三种组成型启动子调控的鼠李糖脂基因在防御假单胞菌中的异源表达及活性研究

论文摘要

本研究利用Red/ET DNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因RhlAB的分泌表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了RhlAB基因在铜绿假单胞菌中的原始启动子,成功获得了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB,pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kanPrhaB-RhlAB,并将这些表达载体分别在防御假单胞菌Pf-5中异源表达,通过LB培养基发酵42 h后,Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂产量为17. 56 mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分别是11. 135 mg/L,441. 135 mg/L,557. 764 mg/L,启动子优化后产量分别是原始启动子的0. 63,25. 12和31. 76倍。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR检测RhlAB基因的表达量,发现启动子替换为Ptac和PrhaB后RhlAB基因表达量分别是原始启动子的2. 16和2. 77倍。本研究初步实现了RhlAB基因在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始启动子表达效率更高,可为异源合成鼠李糖脂提供重要参考。

论文目录

• 1 材料和方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 菌株及质粒
•     1.1.2 培养基
•     1.1.3 试剂及溶液
•     1.1.4 主要仪器设备
•     1.1.5 相关引物
•   1.2 方法
•     1.2.1 相关重组质粒的构建
•     1.2.2 电转化
•     1.2.3 鼠李糖脂检测
•     1.2.4 生长曲线和产鼠李糖脂曲线的测定
•     1.2.5 鼠李糖脂的产物分析
•     1.2.6 实时荧光定量PCR （qRT-PCR） 检测RhlAB的表达
• 2 结果与分析
•   2.1 重组质粒的构建
•   2.2 重组工程菌的构建
•   2.3 重组工程菌生长曲线和产鼠李糖脂曲线的测定
•   2.4 LC-MS/MS对鼠李糖脂产物的结构分析
•   2.5 实时荧光定量PCR （qRT-PCR） 检测RhlAB基因的表达调控
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 谢芝玲,陈汉娜,钟林,徐佳莹,李演,潘登,刘峰,丁学知,夏立秋,张友明,涂强

关键词: 同源重组,鼠李糖脂

来源: 激光生物学报 2019年03期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 淡水鱼类发育生物学国家重点实验室湖南师范大学生命科学学院微生物分子生物学湖南省重点实验室,山东大学亥姆霍兹生物技术研究所微生物技术国家重点实验室山东大学生命科学学院,化学与分子工程学院青岛科技大学

基金: 湖南省发展生物工程和新产品合作创新中心项目(20134486),中国博士后科学基金项目(2018M632669),高等学校学科创新引智计划项目(B16030),济南市农业应用技术创新计划项目(201804)

分类号: Q78

页码: 229-238

总页数: 10

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