表达外源基因的重组鸭坦布苏病毒的构建与稳定性研究

论文摘要

自2010年以来,新发鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）病在我国广泛流行,给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。本研究拟利用弱毒疫苗株（FX2010-180P）建立的反向遗传操作系统,探索在该致弱毒株基因组的不同位置插入报告基因,找到一处能够表达外源蛋白的插入位点,为以后新型疫苗的研发奠定基础。为了探究DTMUV是否能够稳定表达外源蛋白,利用融合PCR等方法,在DTMUV基因组的5’非编码区（UTR）与C基因、C基因与PrM基因、PrM基因与E基因、E基因与NS1基因之间分别插入绿色荧光蛋白基因（EGFP）,并在基因之间插入表达口蹄疫2A蛋白的序列;在NS5基因与3’UTR之间插入内部核糖体引入位点（IRES）与EGFP,进而获得5’端含有启动子、外源基因序列的FX2010-180P株全长cDNA。然后以此为模板进行体外转录,得到具有感染性的RNA,将其转染至DF-1细胞4d后,只有NS5基因与3’UTR之间插入外源基因的转染孔出现了表达绿色荧光蛋白的重组DTMUV。将重组病毒连续传代,发现随着传代次数的增加荧光强度逐渐减弱,传至P5代荧光完全消失。测序结果显示,重组病毒不仅丢失了IRES 3’端506个核苷酸以及整个EGFP,而且还丢失了FX2010-180P株3’端紧挨着终止密码子的67个核苷酸。鉴于此,我们人为缺失这67个核苷酸,同时插入IRES与EGFP,同样方法进行重组病毒拯救,发现病毒能够增殖并且产生与亲代毒相似的细胞病变,传至第5代后荧光逐渐减弱,P7代后荧光完全消失,说明缺失这67个核苷酸的重组病毒依旧不能稳定表达外源蛋白。通过高通量测序发现,P2代重组病毒中至少含有12种不同长度序列缺失的病毒,缺失位置也不一致,每个位置丢失序列的长度也不尽相同。继续传代后发现细胞上清中重组病毒种类逐渐减少,最后以一种或者几种比较优势的状态存在。本研究证明在NS5基因与3’UTR之间虽然能够插入并表达外源基因,但是传代后不稳定;本研究获得一系列序列缺失病毒,为研究黄病毒基因稳定性的分子机制提供了素材,为构建稳定表达外源基因的病毒载体奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
•   1.1 黄病毒概述
•   1.2 DTMUV概述
•   1.3 DTMUV发育史及研究进展
•     1.3.1 DTMUV发育史
•     1.3.2 DTMUV研究进展
•   1.4 DTMUV分子生物学特性
•     1.4.1 DTMUV形态结构
•     1.4.2 DTMUV基因组结构及各蛋白功能
•   1.5 黄病毒反向遗传操作系统的应用
•   1.6 表达外源蛋白的重组黄病毒反向遗传操作系统的应用
•   1.7 研究目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 病毒、细胞和质粒
•   2.2 主要试剂与仪器
•     2.2.1 主要试剂
•     2.2.2 主要仪器
•   2.3 方法
•     2.3.1 鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010-180P的病毒拯救
•       2.3.1.1 坦布苏病毒拯救流程
•       2.3.1.2 FX2010-180P全基因组分片段扩增引物设计
•       2.3.1.3 特异性反转录引物设计
•       2.3.1.4 阳性质粒的提取
•       2.3.1.5 FX2010-180P全长分段cDNA扩增
•       2.3.1.6 细胞准备
•       2.3.1.7 体外转录
•       2.3.1.8 转染
•       2.3.1.9 病毒检测
•       2.3.1.10 病毒增殖
•       2.3.1.11 病毒RNA提取
•       2.3.1.12 病毒RNA反转录
•       2.3.1.13 拯救病毒全基因组分片段扩增
•       2.3.1.14 病毒效价滴定
•       2.3.1.15 病毒生长曲线测定
•     2.3.2 表达外源蛋白的重组鸭坦布苏病毒弱毒株的病毒拯救
•       2.3.2.1 外源基因插入位点设计方案
•       2.3.2.2 将外源基因插入到5'UTR和 C基因之间
•       2.3.2.3 将外源基因插入到C基因和PRM基因之间
•       2.3.2.4 将外源基因插入到PRM基因和E基因
•       2.3.2.5 将外源基因插入到E基因和NS1 基因之间
•       2.3.2.6 NS5基因和3'UTR之间插入IRES和EGFP
•       2.3.2.7 重组病毒各片段扩增引物
•       2.3.2.8 重组病毒质粒构建
•       2.3.2.9 目的片段磷酸化
•       2.3.2.10 磷酸化产物与载体连接
•       2.3.2.11 将连接产物转入感受态细胞
•       2.3.2.12 阳性质粒的提取
•       2.3.2.13 融合PCR获得重组病毒全长c DNA
•       2.3.2.14 体外转录
•       2.3.2.15 转染
•       2.3.2.16 拯救病毒传代及全基因组测序
•       2.3.2.17 二级结构预测
•       2.3.2.18 R-180P-EGFP-67 重组病毒拯救
•       2.3.2.19 sanger测序及高通量测序
• 3 结果与分析
•   3.1 弱毒株FX2010-180P拯救结果
•     3.1.1 弱毒株FX2010-180P分段PCR扩增结果
•     3.1.2 弱毒株FX2010-180P全长cDNA扩增
•     3.1.3 拯救病毒在DF-1细胞上的病变情况
•     3.1.4 拯救病毒的IFA鉴定结果
•     3.1.5 拯救病毒分段PCR扩增
•     3.1.6 病毒生长曲线测定
•   3.2 重组病毒全长cDNA扩增结果
•     3.2.1 重组病毒前三段融合PCR结果
•     3.2.2 重组病毒全长PCR产物的扩增
•     3.2.3 重组病毒拯救结果
•     3.2.4 NS5-3'UTR插入外源基因后重组病毒测序结果
•     3.2.5 二级结构预测结果
•     3.2.6 3'UTR非编码区5'端去掉67 个碱基后重组病毒拯救结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘性坡

导师: 刘思当

关键词: 鸭坦布苏病毒,重组,外源基因,表达,反向遗传操作

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家重点研发计划,项目名称:新发与再现畜禽重大疫病的致病与免疫机制研究项目编号:(2016YFD0500100),课题名称:鸭坦布苏病毒的传播与致病的分子机制,课题编号:(2016YFD0500106)

分类号: S852.65

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