上游序列转录复合物（USTC）调控piRNA转录的机制研究

论文摘要

小RNA是重要的基因调控分子。自RNA干扰现象被发现以来,在秀丽隐杆线虫中发现了多种小RNA。其中,piRNAs（Piwi-interacting RNAs）是一种在动物中高度保守的小RNA。在多种动物中,piRNA抑制转座子与非我基因的表达,维持基因组稳定性,是配子形成的重要因素。在秀丽隐杆线虫中,piRNA开启了基因沉默的代际遗传。大多数piRNA前体从基因组上含有上千个独立的piRNA转录单元的两个基因簇中转录。之后,piRNA转录本经过一系列加工过程,并结合到Piwi蛋白上。尽管我们已经知道一些基因参与piRNA的生成过程,但是,piRNA的转录与加工过程并不完全明朗。本文利用遗传学,细胞生物学,分子生物学中的多种技术来研究秀丽隐杆线虫中的piRNA生成机制。首先,我们利用MosSCI技术构建了单拷贝GFP::3xFLAG标记的TOFU（Twenty-One-u Fouled Ups）基因的转基因线虫。我们发现TOFU-1,TOFU-2和TOFU-7定位在生殖腺细胞质中。TOFU-3,TOFU-4和TOFU-5在生殖腺细胞核中与piRNA生成因子PRDE-1蛋白共定位。利用显微成像和ChIP实验,我们发现TOFU-5的细胞核内定位与染色体分布依赖于PRDE-1,SNPC-4,TOFU-4以及其自身的SANT结构域。TOFU-4的细胞核内定位与染色体分布依赖于PRDE-1,SNPC-4和TOFU-5。我们通过深度测序,发现PRDE-1,SNPC-4,TOFU-4和TOFU-5结合在piRNA基因簇并且定位在piRNA基因的上游。然而,PRDE-1和TOFU-4只结合基因簇内有Ruby motif的piRNA,SNPC-4和TOFU-5结合两类piRNA基因以及一些其他的编码或非编码RNA基因的上游。我们定义了一个包含PRDE-1,SNPC-4,TOFU-4和TOFU-5四个蛋白的结合在piRNA基因启动子上游的转录相关复合物,Upstream Sequence Transcription Complex（USTC）。USTC复合物在piRNA转录过程中起重要作用。TOFU-6在细胞质和P-granule中表达,并且参与piRNA的加工过程。最后,我们通过观察TOFU-5::GFP亚细胞定位来寻找更多的参与piRNA转录或者影响piRNA基因簇染色质结构的新因子。通过反向遗传筛选我们找到一些与TOFU-5::GFP亚细胞定位相关的基因,其中,包括tbp-1,mes-2,mes-3和mes-6。在这些基因的RNA干扰线虫中,TOFU-5::GFP的聚集消失。我们认为H3K27me3的修饰可能与TOFU-5::GFP聚集的形成相关。另外,我们通过正向遗传学筛选找到另一个未知基因pfd-1（piRNA foci defective1）。在pfd-1突变体中,TOFU-5::GFP的聚集也消失。因此,我们开发了一种新的利用TOFU-5::GFP作为报告基因来筛选影响piRNA转录和染色体结构的正向遗传学筛选手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 秀丽隐杆线虫简介
•   1.2 线虫中的RNA干扰现象
•     1.2.1 线虫中的小RNA
•     1.2.2 线虫中的细胞核内RNA干扰通路
•     1.2.3 线虫中RNA干扰的代际遗传
•   1.3 piRNA通路
•     1.3.1 piRNA的功能
•     1.3.2 piRNA的生成
•   1.4 本课题的目的与意义
• 第2章 实验材料与方法
•   2.1 线虫品系
•   2.2 实验相关仪器
•   2.3 实验相关试剂
•   2.4 线虫的培养、传代与杂交
•   2.5 线虫的冻存与复苏
•   2.6 线虫中的RNAi
•     2.6.1 线虫RNA干扰菌的构建
•     2.6.2 线虫RNA干扰实验
•   2.7 线虫的显微观察
•   2.8 线虫的免疫荧光染色
•   2.9 正向遗传筛选
•   2.10 SNP遗传定位
•   2.11 线虫DNA的提取
•   2.12 线虫的显微注射
•   2.13 利用MosSCI技术构建转基因线虫
•   2.14 线虫中的染色质免疫共沉淀
•     2.14.1 线虫染色质免疫共沉淀实验
•     2.14.2 线虫染色质免疫共沉淀测序分析
•   2.15 荧光定量PCR
•   2.16 线虫RNA的提取与处理
•     2.16.1 线虫RNA的提取
•     2.16.2 线虫RNA的处理
•     2.16.3 RNA测序分析
•   2.17 线虫蛋白质的提取与免疫印迹实验
•   2.18 线虫后代数量的统计
•   2.19 线虫生长速率的统计
•   2.20 利用CRISPR技术构建线虫突变体
• 第3章 实验结果与讨论
•   3.1 TOFU蛋白在线虫生殖腺细胞中的亚细胞定位
•   3.2 tofu-3,-4,-5参与piRNA的转录
•     3.2.1 tofu-3,-4,-5的缺失导致piRNA量降低
•     3.2.2 TOFU-3,-4,-5与PRDE-1在生殖腺细胞核内共定位
•     3.2.3 细胞核中TOFU-5的亚细胞定位依赖于TOFU-4和PRDE-1
•     3.2.4 TOFU-5结合在piRNA启动子处并依赖于TOFU-4和PRDE-1
•     3.2.5 TOFU-5核内定位依赖于SANT结构域和SNPC-4
•     3.2.6 细胞核中TOFU-4的亚细胞定位依赖于PRDE-1,TOFU-5和SNPC-4
•     3.2.7 TOFU-4结合在piRNA启动子处并依赖于PRDE-1
•     3.2.8 TOFU-4 TOFU-5,PRDE-1和SNPC-4蛋白富集在四号染色体的piRNA基因簇
•     3.2.9 PRDE-1, SNPC-4, TOFU-4和TOFU-5结合在Ruby motif
•     3.2.10 SNPC-4和TOFU-5结合二类piRNA基因启动子
•   3.3 tofu-6参与piRNA的加工
•     3.3.1 tofu-6突变导致piRNA量降低
•     3.3.2 TOFU-6定位在生殖腺细胞质和P-Granule中
•   3.4 基于TOFU-5的亚细胞定位遗传筛选piRNA的调控因子
•     3.4.1 TBP-1参与piRNA的生成
•     3.4.2 MES-2,-3,-6影响TOFU-5的亚细胞定位
•     3.4.3 正向遗传筛选参与piRNA转录的调控基因
•   3.5 总结与讨论
•     3.5.1 piRNA的命运决定
•     3.5.2 TOFU-5和SNPC-4的其他功能
•     3.5.3 tbp-1基因的功能研究
•     3.5.4 组蛋白甲基化与piRNA之间的关联
•     3.5.5 pfd-l基因的功能研究
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 翁晨春

导师: 光寿红

关键词: 秀丽隐杆线虫,基因

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q75

总页数: 108

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