RNase R在大肠杆菌的表达和条件优化

论文摘要

近些年来,RNA研究领域特别是环状RNA算是目前生物医学研究领域的新兴热点方向之一,RNase R的活性直接影响其处理后环状RNA的质量,因此RNase R的生产和纯化值得深入的研究。核糖核酸外切酶R（RNase R）可降解几乎所有的线性RNA分子和Y结构RNA,但不易降解环形RNA（circRNA）、套索结构（lariat RNA）和3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子,因此可以构建内含子cDNA文库用于可变剪切研究。本研究从NCBI基因库找到了来源于大肠杆菌的核糖核酸酶R,从GDMCC购得含目的基因的菌株E.coli K12,提取基因组并以此为模板进行PCR,获得了目的基因。本研究的主要内容及结果如下:对目的基因rnr通过PCR进行扩增,并构建重组质粒pET22b-rnr;将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选出重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET22b-rnr。在LB培养基中对重组菌进行诱导以表达酶蛋白,通过SDS-PAGE分析其分子量大小。通过Ni柱亲和层析得到纯化的重组RNase R,并用酿酒酵母Total RNA作为底物进行酶活性测定,通过和RNase R（GESENEED公司）的对比实验表明本实验表达制备的RNase R酶活性接近或超过商业酶。由于不同条件下大肠杆菌外源蛋白表达量有较大差异,在已成功表达RNase R的基础上,本研究对重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET22b-rnr进行表达条件的单因素优化实验,实验结果表明BL21（DE3）/pET22b-rnr的最佳诱导温度是20℃、最佳诱导点OD600是0.8、最适IPTG诱导剂量为0.8 mM、最适诱导时间为4h,此时目的蛋白可溶性表达量最高,达到了79.26 mg/L,较出发条件提高了54.7%。本研究还构建4种分子伴侣共表达菌（pGro7、pKJE7、pTf16和pG-Tf2,4种分子伴侣质粒分别与重组质粒pET22b-rnr共表达）,筛选最适分子伴侣质粒,并优化共表达条件,提高目的蛋白可溶性表达。实验表明,分子伴侣质粒pGro7使蛋白表达量提高了43.80%,效果最为明显;20℃诱导时目的蛋白的可溶性表达最高;当L-阿拉伯糖浓度为0.50mg/mL时,蛋白表达量提高到了82.98 mg/L。通过分子伴侣共表达及优化表达条件提高了RNase R的可溶性表达水平,为该酶进一步应用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一章 绪论
•   1.1 核糖核酸外切酶
•   1.2 RNase R的结构
•   1.3 RNase R的生理功能
•   1.4 RNase R的体内调节
•   1.5 RNase R的外源表达
•   1.6 RNase R的纯化方法
•   1.7 RNase R的研究进展
•   1.8 立题背景及意义
•     1.8.1 立题意义
•     1.8.2 主要研究内容
• 第二章 核糖核酸酶R在重组大肠杆菌中高效表达
•   2.1 引言
•   2.2 材料与仪器
•     2.2.1 主要仪器与设备
•     2.2.2 主要实验试剂
•     2.2.3 菌株和质粒
•     2.2.4 培养基与溶液的配制
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 菌株的培养与保存方法
•     2.3.2 RNase R重组大肠杆菌的构建
•     2.3.3 重组菌发酵、纯化与酶活测定
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 目的基因鉴定
•     2.4.2 核糖核酸酶重组质粒的构建
•     2.4.3 重组核糖核酸酶RNase R的发酵与纯化
•   2.5 本章小结
• 第三章 重组RNase R在大肠杆菌中的发酵条件优化
•   3.1 引言
•   3.2 材料与仪器
•     3.2.1 主要仪器与设备
•     3.2.2 主要试剂
•     3.2.3 菌株和质粒
•     3.2.4 培养基与溶液的配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 菌株的培养与保存方法
•     3.3.2 重组RNase R的发酵条件优化
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 不同诱导时间对蛋白表达的影响
•     3.4.2 不同诱导点对蛋白表达的影响
•     3.4.3 不同诱导温度对蛋白表达的影响
•     3.4.4 不同诱导剂量对蛋白表达的影响
•   3.5 本章小结
• 第四章 分子伴侣共表达对RNase R可溶性表达的影响
•   4.1 引言
•   4.2 材料与仪器
•     4.2.1 主要仪器与设备
•     4.2.2 主要试剂
•     4.2.3 菌株和质粒
•     4.2.4 培养基与溶液的配制
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 菌株的培养与保存方法
•     4.3.2 分子伴侣共表达菌株的构建
•     4.3.3 分子伴侣共表达菌的发酵与纯化
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 分子伴侣共表达菌的构建
•     4.4.2 重组RNase R的发酵与纯化
•     4.4.3 共表达菌表达条件的优化
•   4.5 本章小结
• 结论与展望
•   结论
•   本论文创新点
•   展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李轲

导师: 韩双艳

关键词: 可溶性表达,发酵条件优化,分子伴侣

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华南理工大学

分类号: Q78

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.001108

总页数: 74

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