用于黄颊长臂猿亲缘关系分析的微卫星标记引物组合及其应用论文和设计

全文摘要

本发明公开了用于黄颊长臂猿亲缘关系分析的微卫星标记引物组合及其应用。共获得黄颊长臂猿11个多态性微卫星位点，等位基因数目较多，多态性高，可以用于黄颊长臂猿的群体遗传学分析，也能够用于分子标记辅助种群管理和繁殖配对的选择。

主设计要求

1.用于黄颊长臂猿亲缘关系分析的微卫星标记引物组合，其特征在于所述的11个微卫星标记引物组合由以下11个微卫星标记的引物组成：微卫星标记1的引物为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；微卫星标记2的引物为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；微卫星标记3的引物为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；微卫星标记4的引物为SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；微卫星标记5的引物为SEQIDNO.9和SEQIDNO.10；微卫星标记6的引物为SEQIDNO.11和SEQIDNO.12；微卫星标记7的引物为SEQIDNO.13和SEQIDNO.14；微卫星标记8的引物为SEQIDNO.15和SEQIDNO.16；微卫星标记9的引物为SEQIDNO.17和SEQIDNO.18；微卫星标记10的引物为SEQIDNO.19和SEQIDNO.20；微卫星标记11的引物为SEQIDNO.21和SEQIDNO.22。

设计方案

1.用于黄颊长臂猿亲缘关系分析的微卫星标记引物组合，其特征在于所述的11个微卫星标记引物组合由以下11个微卫星标记的引物组成：

微卫星标记1的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；微卫星标记2的引物为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4；微卫星标记3的引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；微卫星标记4的引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；微卫星标记5的引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；微卫星标记6的引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；微卫星标记7的引物为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；微卫星标记8的引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；微卫星标记9的引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；微卫星标记10的引物为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；微卫星标记11的引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。

2.根据权利要求1所述的微卫星标记引物组合，其特征在于微卫星标记1、2、9、10的上游引物5’端用FAM荧光染料标记；微卫星标记3、8、5的上游引物5’端用TAMRA荧光染料标记；微卫星标记4、6、7、11的上游引物5’端用HEX荧光染料标记。

3.权利要求1或2所述的微卫星标记引物组合在黄颊长臂猿亲缘关系分析中的应用。

4.权利要求1或2所述的微卫星标记引物组合在黄颊长臂猿亲缘关系谱的鉴定中的应用。

设计说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及用于黄颊长臂猿亲缘关系分析的微卫星标记引物组合及其应用。

背景技术

黄颊长臂猿(Nomascus gabriellae)隶属长臂猿科，冠长臂猿属，仅分布于老挝南部、柬埔寨东部和越南中部和南部的低地森林，主要以植物的果实、树叶、嫩枝、花朵为食，也兼食少量的昆虫、鸟卵。因受栖息地丧失和狩猎因素的威胁，野生黄颊长臂猿数量不断减少，已被IUCN列为极危种。目前，关于黄颊长臂猿微卫星的研究尚未见报道，多数黄颊长臂猿种群存在亲缘关系模糊、谱系不精确等问题。这种问题在圈养种群中尤为突出，不利于迁地保护向就地保护转变。本研究将研发黄颊长臂猿的微卫星标记，以其为该物种展开亲缘关系鉴定工作，建立精确的谱系，了解个体间的血缘关系，同时有助于采取有针对性的措施来保持遗传多样性，从而促进黄颊长臂猿物种保护的有效、科学、可持续地发展。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述问题，提供一种用于黄颊长臂猿亲缘关系分析的微卫星标记引物组合。

本发明的另一目的是提供该微卫星标记引物组合的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

用于黄颊长臂猿亲缘关系分析的微卫星标记引物组合，所述的11个微卫星标记引物组合由以下11对微卫星标记的引物组成：

第1对：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；

第2对：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示；

第3对：正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物如SEQ ID NO.6所示；

第4对：正向引物如SEQ ID NO.7所示；反向引物如SEQ ID NO.8所示；

第5对：正向引物如SEQ ID NO.9所示；反向引物如SEQ ID NO.10所示；

第6对：正向引物如SEQ ID NO.11所示；反向引物如SEQ ID NO.12所示；

第7对：正向引物如SEQ ID NO.13所示；反向引物如SEQ ID NO.14所示；

第8对：正向引物如SEQ ID NO.15所示；反向引物如SEQ ID NO.16所示；

第9对：正向引物如SEQ ID NO.17所示；反向引物如SEQ ID NO.18所示；

第10对：正向引物如SEQ ID NO.19所示；反向引物如SEQ ID NO.20所示；

第11对：正向引物如SEQ ID NO.21所示；反向引物如SEQ ID NO.22所示；

所述的微卫星标记引物组合优选：微卫星标记1、2、9、10的上游引物5’端用FAM荧光染料标记；微卫星标记3、8、5的上游引物5’端用TAMRA荧光染料标记；微卫星标记4、6、 7、11的上游引物5’端用HEX荧光染料标记。

本发明所述的微卫星标记引物组合在黄颊长臂猿亲缘关系分析中的应用。

这些微卫星位点的研发可用于黄颊长臂猿亲缘关系分析和亲缘关系谱的鉴定，以及黄颊长臂猿的种群管理与保护。

本发明具有以下优点：

1)本发明按照微卫星荧光标记的颜色不同进行分组，将每组的多个微卫星位点产物混合在一起上样，比正常PCR检测方法提高了3倍效率，同时节约了成本和时间。

2)本发明选择的微卫星位点等位基因数目较多，多态性高，亲缘分析数据准确，可以用于黄颊长臂猿的群体遗传学评价，为黄颊长臂猿的种群管理和发展提供了遗传学依据。

3)首次在黄颊长臂猿上利用荧光标记的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定未知一方亲本的准确率达到了98.2％。本发明能快速、有效地鉴别黄颊长臂猿的亲本，为黄颊长臂猿的选育和繁殖配组提供了依据。

附图说明

图1微卫星序列扩增其中,从左至右第1-5泳道:微卫星位点1-5；第6泳道:D2000MAKER；第7-12泳道:微卫星位点6-11.

图2微卫星标记1图谱

图3微卫星标记2图谱

图4微卫星标记3图谱

图5微卫星标记4图谱

图6微卫星标记5图谱

图7微卫星标记6图谱

图8微卫星标记7图谱

图9微卫星标记8图谱

图10微卫星标记9图谱

图11微卫星标记10图谱

图12微卫星标记11图谱

具体实施方式

实施例1

1.基因组DNA提取

取20根带毛囊的黄颊长臂猿毛发分别放于2ml的离心管中，加入600μL的细胞裂解液 (Tris-HCl 100mM，pH 8.0；EDTA 50mm\/L，pH 8.0；SDS1％，pH 8.0；NaCl 125mM)，在每个管中加入浓度为20mg\/mL的蛋白酶K 9μL，放入60℃水浴锅中水浴2-4h，每隔半小时摇动下离心管，直到组织充分裂解。将离心管冷却至室温，加入200μL 7.5M的醋酸铵，充分摇匀，放置于4℃冰箱内冷却5min，12000rpm 4℃离心10min，取500ml上清液至新1.5ml离心管。加入600ml异丙醇，充分混匀，室温下沉淀1-2min，12000rpm 4℃离心10min，弃去异丙醇。加入70％的酒精洗涤DNA，12000rpm 4℃离心5min，弃去70％的酒精。加入无水乙醇，12000rpm 4℃离心5min，弃去无水乙醇，反复几次，室温干燥约30min，加入100μL双蒸水溶解DNA。

2.引物筛选

以微卫星标记的序列重复单位、杂合度、多态信息含量和片段大小等特性为依据筛选25 个位点。梯度PCR反应体系为：Mix 12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，双蒸水6.5μL， DNA模板5μL。梯度PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，49℃-60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

以黄颊长臂猿个体DNA为模板来检测每个微卫星位点的最佳PCR扩增条件，挑选出多态性较高、扩增效果最好的微卫星位点用以开发荧光PCR体系。

3.多态性微卫星标记筛选和反应体系：

将多态性高、扩增条件好的微卫星位点，相应引物的上游引物5’端分别用FAM,HEX，TAMRA 三种荧光染料进行标记。参考普通PCR的反应体系与反应条件，进行荧光标记引物的PCR扩增。

25对微卫星引物的梯度PCR扩增结果表明,有8对引物没有扩增产物，17对引物符合有符合要求的目的条带。对这17对引物进行荧光标记的PCR扩增，并进行SSR分型检测，根据 SSR分型检测报告，根据每个图谱峰值的位点位置和大小、片段大小，同时判断纯合子(单峰) 或杂合子(双峰)，挑选出适合的微卫星位点。结果显示仅11对荧光引物扩增出来的图谱峰值的位点位置和大小、片段大小是正确的(如图2-12)，其余6对出现错峰、位点较多不符合孟德尔定律等情况。具有多态性的微卫星引物序列、反应条件见表1。

表1 11对黄颊长臂猿微卫星特征

实施例2

1.实验对象及方法

利用实施例1中筛选到的11个微卫星位点的引物对经物种鉴定确认为黄颊长臂猿的14 只黄颊长臂猿进行亲缘关系分析。

采集黄颊长臂猿毛发，按实施例1中基因组提取方法提取长臂猿毛囊中的基因组DNA。提取后的基因组DNA样本于-20℃保存，备用。以提取的基因组DNA为模板，分别以上述11对引物进行PCR；利用上述11对引物进行扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500 作为内参，用GeneMarkerV1.5软件读取个体的基因型。采用软件CERVUS 3.0计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率及无效等位基因频率，并跟据LOD累积排除概率鉴定每个家系个体的父母本(见表2)。

2.遗传多样性分析

将11对英光引物的PCR产物在ABI3730XL基因分析仪上进行检测，结果11个微卫星位点，共检测出41个等位基因。运行Cervus3.0中的Allen Frequentcy Analysis程序，得到11 个微卫星位点在14个个体中的遗传信息参数(表2)。结果表明，平均等位基因数(K)为3.7，多态信息含量(PIC)在0.175-0.701之间，平均多态信息含量为化0.463，属于中度多态位点(0.25＜PIC＜0.5)；观测杂合度(Ho)在0.067-0.8之间，平均值为化0.387，期望杂合度(He)在0.191-0.770之间，平均值为0.502，Ho＜He，基因杂合度水平较低，无效等位基因频率较高，是遗传多样性较差的群体。

表2 11个微卫星位点在14个黄颊长臂猿中的遗传信息参数分析

注：K为位点等位基因数；N为基因分型的个体数：Ho为位点观测杂合度；He为位点期望杂合度；PIC为位点多态信息含量；E-1P为第一个亲本的排除概率；E-2P为第二个亲本的排除概率；E-pp为双亲的排除概率；HW为哈迪温伯格平衡；F(Null)为无效等位基因频率；ND表示未检测出.Cumulative exclusion frequecy为累积排除概率。

3.微卫星位点的亲权排除率

亲权排除率的分析表明，微卫星位点的排除概率与位点数和位点多态信息含量均呈正相关。11个微卫星位点中，当2个亲本基因型均未知时，单个位点的第一亲本排除率(E-1P) 介于0.665-0.983之间，8个位点的累积排除概率为0.8601；当1个亲本基因型己知，单个位点的第二亲本排除率(E-2P)介于0.488-0.907之间，8个位点的累积排除概率为0.9821；当双亲基因型己知时，单个位点的双亲排除率介于0.307-0.781之间，8个位点的累积排除概率为0.999。

4.亲缘系数

通过Cervus3.0软件进行亲缘系数结果见表1。已知大黄家族中，母本为大黄，父本为大黑，子一代分别为园园、冬至、乐乐、夏天，其中大黄正处于孕期未采集样本检测。其大黑与园园、冬至、乐乐、夏天的亲缘系数分别为0.4761，0.4765、0.5568、0.5062；其子代间亲缘系数在0.2619-0.7545之间。另一已知家族中，母本为黄婆，父本为园园，子代为恩奇。其母子亲缘系数为0.4526，父子亲缘系数为0.4526，亲本间亲缘系数为0.1332。同父母九九和小七，亲缘系数为0.4717。这些数值符合已知的谱系记载情况。

表3 14只黄颊长臂猿的亲缘系数(r)结果

Ps；1.九九，2.乐乐，3.夏天，4.冬至，5.恩奇，6.小黄，7.迪克，8.黄婆，9.三兮，10.小小，11.小四， 12.园园，13.大黑，14.六华。

序列表

<110> 南京市红山森林动物园管理处

<120> 用于黄颊长臂猿亲缘关系分析的微卫星标记引物组合及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA