静/动态培养模式对CIK细胞体外扩增与代谢特性的影响及其机制

论文摘要

过继性免疫细胞疗法是一种非常有前景的肿瘤疾病治疗手段。细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine induced killer,CIK）是过继性免疫细胞疗法中常用的效应细胞之一,基于CIK细胞的免疫细胞疗法目前在多种肿瘤疾病的临床治疗中取得了积极的成果,具有广阔的应用前景。由于细胞治疗的效果与输注细胞的数量和质量密切相关,因此是否能在短时间内获得足够数量且具有高抗肿瘤活性的CIK细胞是决定该疗法能否取得预期疗效的关键环节之一。目前CIK细胞的体外制备过程通常是采用培养袋进行静态培养,但该培养模式由于混合效果和气液传质能力差,容易使营养物或代谢副产物产生浓度梯度,导致培养环境不均一且难以控制,不仅影响细胞扩增的效果以及所获得CIK细胞的功能,也使得扩增工艺过程难以重复。为解决这一问题,本文尝试建立CIK细胞的动态培养技术,期待通过良好的混合解决培养环境不均一的问题,通过增加物质传递提高营养物的利用效率,从而实现CIK细胞的高效扩增,为将来建立基于生物反应器的CIK细胞或其它免疫效应细胞的高效规模化扩增技术提供技术支撑。本文采用有血清培养体系以脐带血单个核细胞（Cord blood mononuclear cells,CBMNC）为起始细胞,首先比较了动静态两种培养模式下CIK细胞的扩增效果,结果发现培养过程中细胞活性、各效应细胞比例的变化并不受培养模式的影响,培养14天后CD3+细胞均从23.42±9.43%提高到90%以上。培养14天后动态培养模式下总细胞扩增倍数可达到69.36±30.36倍,显著高于静态培养的9.24±1.12倍（P<0.05）,其中主要的效应细胞CD3+CD56+细胞可扩增2579.47±2242.43倍,同样明显高于静态培养的505.80±510.21倍（P<0.05）。进一步分析CD3+细胞中与细胞增殖相关的活化抗原CD69、CD25和CD71表达,结果发现动态培养模式下CD3+细胞群中CD3+CD69+细胞、CD3+CD25+细胞和CD3+CD71+细胞比例明显高于静态培养（P<0.05）,故而推测动态培养模式有可能促使更多的CD3+细胞进入了活化状态,从而提高了细胞的扩增效率。此外,还比较了两种培养模式下扩增获得的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性、与杀伤活性正相关的细胞膜表面CD107a分子、胞内穿孔素和颗粒酶B的表达水平,以及细胞因子TNF-α及IFN-y分泌能力,发现两种培养模式下与杀伤活性相关的指标均相近。可见,动态培养模式能在维持细胞功能的同时获得更高的效应细胞扩增效果。在此基础上,本文对两种培养模式下CIK细胞扩增的动力学参数以及代谢特性进行了分析和比较。结果发现在动态培养模式下,不仅CIK细胞的最大比生长速率、葡萄糖比消耗速率均明显高于静态培养,而且总细胞、CD3+细胞和CD3+CD56+细胞对葡萄糖的得率也明显高于静态培养,表明动态培养模式提高了细胞代谢葡萄糖的速率,其吸收的葡萄糖更多地用于支持细胞的快速生长。此外,尽管动态培养模式下乳酸比生成速率高于静态培养,但两种培养模式下细胞的乳酸对葡萄糖得率相近,均在1.5～2之间,说明细胞吸收的葡萄糖经代谢后大部分转化成了乳酸。为了进一步认识动态培养细胞加快葡萄糖代谢速率的原因,本文从葡萄糖转运和关键途径代谢酶活性等角度出发,分析培养模式对CIK细胞糖代谢的调控作用。结果发现与静态培养相比,采用动态培养所扩增的CIK细胞,其表面葡萄糖转运子GLUT1蛋白表达水平明显提高,提示细胞摄取葡萄糖的能力增强,且.在动态培养模式下细胞中糖酵解和磷酸戊糖途径关键酶PFK和G6PDH的酶活活性分别比静态培养细胞高了60%和62%,这一结果与动态培养条件下细胞的葡萄糖比消耗速率增加相吻合。另外,动态培养细胞的G6PDH/PFK比酶活明显高于静态培养,说明动态培养细胞的葡萄糖代谢更多地向磷酸戊糖途径发生了迁移,而磷酸戊糖途径的主要生理功能之一是为生物合成提供原材料,因此,这一结果也与动态培养模式下细胞比生长速率以及细胞对葡萄糖的得率较高相一致。考虑到谷氨酰胺也是哺乳动物细胞生长所必需的重要碳源/能源物质,本文也比较了两种培养模式下扩增的CIK细胞对谷氨酰胺的代谢行为。结果发现与静态培养模式相比,动态培养模式下CIK细胞的谷氨酰胺比消耗速率及其代谢副产物氨的比生成速率以及总细胞、CD3+细胞和CD3+CD56+细胞对谷氨酰胺的得率均显著提高,提示动态培养模式提高了细胞代谢谷氨酰胺的速率,其吸收的谷氨酰胺更多地用于支持细胞自身的快速生长。比较谷氨酰胺转运子ASCT2、SNAT1、SNAT2和CD98/LAT1的表达水平,结果显示动态培养模式下细胞中这些转运子的表达均上调,提示细胞的谷氨酰胺转运能力获得提高。进一步分析与谷氨酰胺相关的GLS和GDH酶的活性变化,动态培养的CIK细胞胞内GLS和GDH酶活均高于静态培养,前者高了20%和23%,提示动态培养可能加快了细胞内谷氨酰胺的分解代谢速率,加强了TCA循环的补给,提高了TCA循环运转以及ATP的生成效率,以达到促进细胞快速生长的效果。为确认这一推测,本文进一步分析比较了动静态两种培养条件获得的CIK细胞生成ATP的能力。鉴于糖酵解和氧化磷酸化是细胞内合成ATP的主要途径,而ECAR和OCR是反映细胞内糖酵解和氧化磷酸化能力的有效指标,因此,本文检测了两种培养模式下细胞的ECAR和OCR。结果发现与静态培养细胞相比,动态培养细胞的基础ECAR值和OCR值分别提高了33%和301%,表明动态培养细胞的基础糖酵解和氧化磷酸化能力均显著高于静态培养,这与动态培养条件下细胞较高的葡萄糖和谷氨酰胺比消耗速率结果相符。计算OCR/ECAR比值发现,动态培养细胞的OCR/ECAR值比静态培养细胞高了3.36倍,表明动态培养细胞的氧化磷酸化代谢更加旺盛。由于经氧化磷酸化生成ATP的效率远高于糖酵解,以上结果也表明动态培养模式下细胞合成ATP的效率更高。综上所述,动态培养提高了细胞摄取外部营养物质的能力,分解代谢向更有利于细胞合成代谢的方向迁移,有利于支持细胞的快速高效扩增。鉴于外周血来源的CIK细胞（Peripheral blood derived-CIK cells,PB-CIK）在临床试验中应用更加广泛,且与脐血来源的CIK细胞相比在生长特性方面可能存在不同之处,本文最后还进行了PB-CIK的动态培养。结果发现,动态培养模式显著提高了总细胞中CD3+CD8+细胞的比例,其它各亚型细胞比例与静态培养模式相近。培养至14天时,总细胞中CD3+细胞和CD3+CD56+细胞的比例分别为92.16±2.25%和19.34±3.07%。计算总细胞与各亚型细胞扩增倍数发现,动态培养至第14天时,总细胞和CD3+CD56+细胞分别扩增了 104.36±8.98倍和522.33±47.98倍,均显著高于静态培养（15.07±1.46倍和82.00±27.73倍）。此外,动态培养模式通过提高PFN+细胞和Gzm B+细胞的比例,增强了扩增后PB-CIK细胞对K562细胞的体外杀伤活性,说明动态培养模式增强了扩增后PB-CIK细胞的生理功能。可见,动态培养模式可以实现不同来源CIK细胞的高效体外扩增。本文详细研究了静/动态培养模式下CIK细胞的生长和代谢特性以及差异,深入探讨了导致细胞生长和代谢差异可能的机制,研究结果对后续建立基于生物反应器的免疫效应细胞规模化培养过程以及无血清培养基的设计研发具有重要的指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩略词对照表
• 第1章 文献综述
•   1.1 过继性免疫细胞疗法的发展历程
•   1.2 CIK细胞的生物学特性
•     1.2.1 CIK细胞的免疫表型
•     1.2.2 CIK细胞的抗肿瘤机制
•   1.3 CIK细胞的临床应用
•   1.4 CIK细胞的体外扩增
•     1.4.1 体外培养模式
•     1.4.2 细胞密度
•     1.4.3 营养物及其代谢副产物
•     1.4.4 培养基和细胞因子
•   1.5 T细胞代谢特性与其体外扩增的关系
•     1.5.1 T细胞代谢特性
•     1.5.2 T细胞代谢特性与其体外扩增的关系
•   1.6 本文主要研究内容及其目的和意义
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验仪器设备
•   2.2 实验材料与试剂
•     2.2.1 脐血与外周血细胞分离试剂
•     2.2.2 肿瘤细胞系
•     2.2.3 血清与培养基
•     2.2.4 细胞因子
•     2.2.5 流式细胞术检测用试剂
•     2.2.6 免疫印迹实验（Western blotting）检测用试剂
•     2.2.7 荧光定量PCR分析所用试剂
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 MNC细胞的分离
• +细胞分离'>    2.3.2 CD3⁺细胞分离
•     2.3.3 CIK细胞的体外培养
•     2.3.4 细胞计数
•     2.3.5 细胞表型分析
•     2.3.6 CIK细胞杀伤活性检测
•     2.3.7 胞内颗粒酶B及穿孔素测定
•     2.3.8 细胞的IFN-γ和TNF-α分泌能力
• +细胞比例测定'>    2.3.9 培养物中CD107a⁺细胞比例测定
•     2.3.10 细胞活化水平测定
•     2.3.11 凋亡细胞比例的测定
•     2.3.12 培养上清中代谢物含量测定
•     2.3.13 GLUT1基因表达水平测定
•     2.3.14 细胞表面GLUT1蛋白和CD98分子表达水平测定
•     2.3.15 免疫印迹法测定ASCT2、SNAT1和SNAT2蛋白表达水平
•     2.3.16 关键代谢酶的酶活测定
•     2.3.17 葡萄糖摄取能力测定
•     2.3.18 细胞胞内的代谢物浓度测定
•     2.3.19 胞外酸化速率和氧比消耗速率的测定
•     2.3.20 培养液pH和渗透压测定
• L）'>    2.3.21 计算流体动力学（CFD）模拟氧传质系数（k_L）
•     2.3.22 统计学分析
• 第3章 培养模式对CIK细胞体外扩增特性及生理功能的影响
•   3.1 实验设计
•   3.2 培养模式对CIK细胞体外扩增特性的影响
•     3.2.1 总细胞扩增
•     3.2.2 各亚型细胞的比例和扩增
•     3.2.3 细胞活化水平
•   3.3 培养模式对扩增后CIK细胞生理功能的影响
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 第4章 培养模式对CIK细胞代谢特性的影响及其机制
•   4.1 培养模式对CIK细胞物质代谢特性的影响及其机制
•     4.1.1 培养模式对葡萄糖代谢的影响及其机制
•     4.1.2 培养模式对谷氨酰胺代谢的影响及其机制
•   4.2 培养模式对CIK细胞能量代谢特性的影响及其机制
•     4.2.1 胞内ATP含量及ATP合成能力
•     4.2.2 氧化还原力
•   4.3 培养模式对理化环境的影响
•     4.3.1 pH和渗透压
•     4.3.2 氧
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 第5章 动态培养模式下PB-CIK细胞的体外扩增
•   5.1 PB-CIK细胞的体外扩增特性
•     5.1.1 总细胞扩增
•     5.1.2 各亚型细胞的比例和扩增
•   5.2 扩增后PB-CIK细胞的生理功能
•   5.3 讨论
•   5.4 本章小结
• 第6章 全文总结与展望
•   6.1 全文总结
•   6.2 本文创新点
•   6.3 建议与展望
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张伟伟

导师: 谭文松

关键词: 细胞因子诱导的杀伤细胞,体外扩增特性,葡萄糖代谢,谷氨酰胺代谢,能量代谢特性

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 华东理工大学

分类号: R730.51;Q813.11

总页数: 113

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