p62及其互作蛋白Vps34在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬中的作用

论文摘要

自噬是细胞内发生功能障碍的组分进行自我降解的一种过程,在维持细胞内稳态的过程中起着重要作用。p62/SQSTM1蛋白作为一种接头蛋白可以调控自噬的发生,同时也可以被自噬途径降解。此外,p62蛋白还可以通过与不同蛋白相互作用来调控不同的信号通路,深入开展p62蛋白的功能研究对于探索细胞自噬过程以及相关的信号转导途径具有重要意义。在本研究中,我们对p62蛋白进行了亚细胞定位分析;使用mTORC1的特异性抑制剂Rapamycin处理小鼠巨噬细胞,观察mTORC1信号通路对p62基因表达的调控作用;构建mTORC2特有组成成分Rictor的靶向shRNA表达载体,并转染小鼠巨噬细胞,观察mTORC2信号通路对p62表达的影响;小鼠巨噬细胞中过表达p62基因,Western blot检测mTORC1和mTORC2信号通路活性变化;利用免疫共沉淀技术获得可以与p62蛋白相互作用的靶蛋白,对这些蛋白进行质谱测序及Western blot验证;使用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠巨噬细胞发生自噬,并通过观察自噬小体形成及自噬相关蛋白Beclin-1和LC3水平的变化,确定p62在LPS诱导细胞自噬过程中的作用;同时,分析与p62蛋白相互作用的靶蛋白,研究这些靶蛋白对LPS诱导细胞自噬的影响。结果表明:1)用绿色荧光标记的p62蛋白可以与红色荧光标记的内质网和高尔基体发生重合,p62可以定位于内质网和高尔基体;2)质谱检测和免疫共沉淀结果表明,p62蛋白、Vps34及FKBP38蛋白相互作用,蛋白相互作用网路分析显示Rictor与p62、FKBP38具有相互作用关系,预示mTORC2可能与p62相关联;3)当mTORC1和mTORC2的活性受到抑制时,p62基因表达显著降低（p<0.05）;在小鼠巨噬细胞中过表达p62基因,提高mTORC1和mTORC2通路活性,反之转录后沉默p62基因则降低mTORC1和mTORC2通路活性;mTORC1和mTORC2通路与p62间存在反馈调节机制4)在LPS引起的细胞自噬过程中,过表达p62时自噬相关蛋白Beclin-1和LC3水平升高,而转录后沉默p62,自噬相关蛋白Beclin-1和LC3水平降低;5)在LPS引起的细胞自噬中,过表达Vps34,自噬相关蛋白Beclin-1和LC3水平升高。总之,通过上述实验我们发现p62蛋白可以定位在内质网和高尔基体,这是除内质网之外,p62在内膜系统的新定位;mTORC1和mTORC2信号通路调控p62的表达,同时p62对mTORC1和mTORC2信号通路的活性具有正向调控作用,存在反馈调节机制;相互作用组分析显示有188种蛋白可能与p62具有直接或间接的相互作用关系;p62促进由LPS引起的细胞自噬,其相互作用蛋白Vps34亦具有促进作用。本文对p62蛋白的亚细胞定位,与mTORC1/2信号通路之间的相互调控关系和p62及其相互作用蛋白在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬过程中发挥作用的研究结果,加深了对p62蛋白特性的了解,为进一步研究p62蛋白在LPS诱导的细胞自噬中发挥的生物学功能提供了基础数据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第一章 P62与细胞自噬的研究进展（综述）
•   1.细胞自噬
•     1.1 自噬的过程
•     1.2 细胞自噬的意义
•   2.P62蛋白及其功能
•     2.1 p62 蛋白的分子特征
•     2.2 p62 蛋白的功能
•       2.2.1 p62 与凋亡
•       2.2.2 p62 与肿瘤发生
•       2.2.3 p62 蛋白与相关信号通路
•   3.P62与自噬
• 第二章 P62 及其互作蛋白VPS34在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬中的作用
•   1.引言
•     1.1 细胞自噬
•     1.2 LPS引起细胞自噬
•     1.3 目的及意义
•   2.材料和方法
•     2.1 材料
•       2.1.1 细胞系
•       2.1.2 菌株及质粒
•       2.1.3 细胞培养、药物处理及转染主要实验材料
•       2.1.4 PCR实验材料
•       2.1.5 Western blot实验材料
•       2.1.6 实验主要仪器设备
•     2.2 方法
•       2.2.1 培养RAW264.7 细胞和Ana-1 细胞
•       2.2.2 激光共聚焦显微镜观察p62在RAW264.7 细胞内质网以及高尔基体上的定位
•       2.2.3 p62 蛋白的相互作用组
•       2.2.4 p62对m TORC1和m TORC2 信号通路的影响
•       2.2.5 p62 的表达调控
•       2.2.6 p62 及相互作用蛋白在LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 自噬中的作用
•       2.2.7 统计学分析
•   3.结果
•     3.1 p62 蛋白在小鼠巨噬细胞RAW264.7 内质网和高尔基体中的定位表达
•       3.1.1 p62 蛋白定位在内质网上
•       3.1.2 p62 蛋白定位在高尔基体上
•     3.2 p62 及其互作蛋白的检测
•       3.2.1 免疫共沉淀证明p62与FKBP38 具有相互作用关系
•       3.2.2 质谱分析证明p62、Rictor结合于FKBP38 的免疫共沉淀复合物中
•       3.2.3 质谱分析证明Raptor结合于p62 免疫共沉淀复合物中
•       3.2.4 质谱分析结果的Co-IP和 Western blot验证
•       3.2.5 相互作用网络分析
•     3.3 p62对mTORC1和m TORC2 信号通路的影响
•       3.3.1 p62 正调控m TORC1 信号通路活性
•       3.3.2 p62 正调控m TORC2 信号通路活性
•     3.4 p62 的表达调控
•       3.4.1 mTORC1 调控p62 表达
•       3.4.2 mTORC2调控p62 表达
•     3.5 p62 及相互作用蛋白在LPS诱导小鼠巨噬细胞自噬中的作用
•       3.5.1 LPS对小鼠巨噬细胞增殖的影响具有时间及浓度依赖性
•       3.5.2 LPS诱导小鼠巨噬细胞自噬
•       3.5.3 p62 促进LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬
•       3.5.4 Vps34 促进LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬
•       3.5.5 FKBP38对LPS诱导的细胞自噬作用不明显
•       3.5.6 p62 及其相互作用蛋白Vps34、FKBP38 影响LPS诱导细胞自噬机制的初步探讨
•   4.讨论
•     4.1 p62 蛋白定位于内质网和高尔基体对延伸其功能具有重要意义
•     4.2 p62与mTOR信号通路的相互调节
•     4.3 p62及Vps34在LPS诱导的细胞自噬中的生物学意义
•   5.结论
• 参考文献
• 附录 Ⅰ
• 附录 Ⅱ
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵萍萍

导师: 王志钢

关键词: 自噬,蛋白,信号通路

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古大学

分类号: Q25

总页数: 79

文件大小: 6358K

下载量: 496