氧化应激通过调节ALS相关蛋白TBK1和OPTN影响线粒体自噬的机制

论文摘要

目的:研究正常状态和氧化损伤条件下,ALS相关蛋白OPTN和TBK1对线粒体自噬的调控作用,并探索该疾病的可能发病机制。方法:（1）在本课题中,我们在细胞中利用药物干预成功构建了表达野生型OPTN和病理突变体OPTN的线粒体自噬模型;（2）开发多通道活细胞成像等技术,观察野生型OPTN和其病理突变体在线粒体自噬过程中的功能及区别;（3）在压力诱导条件下,（用氧化损伤诱导物H202处理细胞）通过生化核质分离、免疫荧光等方法分析OPTN在细胞中的定位变化;（4）利用线粒体自噬报告工具mt-Keima以及用Western Blotting检测线粒体蛋白等技术分别观察在氧化损伤条件下野生型及突变型OPTN的定位改变对线粒体自噬水平的影响;（5）通过免疫共沉淀,免疫荧光等技术鉴定在氧化压力过程中OPTN-TBK1的结合情况,并利用细胞生物学及生化实验探索TBK1-OPTN结合与线粒体解离和OPTN核转运之间的关系;（6）通过神经元原代培养模拟在体环境,探究在神经元中OPTN的核转运与氧化损伤之间的关系,研究在此过程中OPTN-TBK1结合对线粒体自噬的影响以及ALS发病的分子机制。结果:（1）当线粒体受损时,OPTN明显促进自噬体对泛素化线粒体的识别,线粒体自噬效率显著提高;（2）与野生型OPTN相比,OPTN的E50K病理突变体可以促进自噬小体对受损线粒体的识别,但却阻碍对受损线粒体的降解;（3）OPTN的ALS病理突变体E478G明显破坏线粒体对自噬体的招募,阻碍受损线粒体的清除;（4）对细胞进行H202处理,检测到野生型及几种突变型OPTN均出现明显的核转移现象;（5）在氧化损伤条件下,TBK1调控OPTN从线粒体解离,并携带OPTN一同转运进核,最终阻碍Parkin介导的线粒体自噬。结论:在氧化损伤条件下,TBK1调控OPTN从线粒体解离,并携带OPTN一同转运进核,这种在压力条件下的核移位现象会破坏Parkin-OPTN线粒体自噬信号轴,最终阻碍受损线粒体的清除。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
•   参考文献
• 材料与方法
•   1. 实验材料与仪器
•     1.1 主要工具细胞
•     1.2 主要抗体与试剂
•     1.3 主要实验仪器
•     1.4 主要试剂配制
•   2. 实验方法
•     2.1 基因突变
•     2.2 克隆实验
•     2.3 细胞生物学实验
•     2.4 核质分离实验
•     2.5 蛋白质免疫印迹实验（Western blotting）
• 结果
•   1. 构建Parkin-OPTN线粒体自噬模型
•   2. OPTN依赖Parkin调控线粒体自噬的作用机制
•   3. OPTN病理突变体阻碍受损线粒体的降解
•   4. 氧化损伤可诱导OPTN核转运
•   5. 氧化损伤诱导OPTN核转运阻碍Parkin介导的线粒体自噬
•   6. 氧化损伤条件下,TBK1调控OPTN核转运,阻碍线粒体自噬
•   7. 氧化损伤条件下,神经元中内源性OPTN的核转运影响Parkin介导的线粒体自噬
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述 关于选择性自噬的研究进展
•   1. Cvt途径
•   2. 线粒体自噬
•   3. 聚集体自噬
•   4. 过氧化物酶体自噬
•   5. 内质网自噬
•   6. 溶酶体自噬
•   7. 结语
•   参考文献
• 攻读学位期间发表的论文及科研成果
• 中英文缩写词表
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王娜娜

导师: 应征,王洪枫

关键词: 氧化损伤,线粒体自噬

来源: 苏州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 苏州大学

分类号: R329.2

DOI: 10.27351/d.cnki.gszhu.2019.002059

总页数: 63

文件大小: 5271K

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