基于广盐聚球藻Synechococcus sp.PCC7002的启动子比较筛选以及产乙醇载体的构建

论文摘要

随着化石燃料消耗的增加以及CO2的大量排放,造成了严重的能源危机和环境问题。蓝藻作为海洋中生物量最大、最重要的初级生产者,对于蓝藻的开发和利用,一直备受关注。聚球藻PCC7002（Synechococcus sp.PCC7002）作为蓝藻中的一种,有着耐高温耐高盐的特性,并且遗传背景清晰,被视为新一代的“细胞工厂”。目前以聚球藻PCC7002对象,进行了大量的代谢工程类的研究,使各分子元件的开发和利用更加成熟。但是,对于启动子在聚球藻PCC7002中的表达强度比较以及启动子强弱对代谢通路中的影响研究有限。本论文以聚球藻PCC7002为研究对象,以绿色荧光蛋白为报告蛋白,使启动子驱动绿色荧光蛋白基因的表达,从而利用荧光强弱来判断启动子的强弱。得到不同启动子的强度后,在聚球藻PCC7002中,通过设计强度不同的启动子组合,分别驱动生物乙醇合成途径中pdc和adh的表达,通过检测乙醇的产量,研究启动子对于乙醇合成的影响。获得主要结果如下:（1）使用绿色荧光蛋白为报告蛋白,分别研究了聚球藻PCC7002和集胞藻PCC6803中与光合作用和CO2同化相关的8个组成型启动子在聚球藻PCC7002中的表达强度,结果表明7002PcpcB、6803PpsaAB启动子为强启动子;6803PpsbDC、6803PcpcB、7002PrbcL 和 7002PpsbDC 启动子为弱启动子;7002PpsaAB和6803PrbcL启动子为超弱启动子。同时,研究了分别由盐离子诱导表达的诱导型启动子,结果表明NaCl浓度为5%时,诱导型启动子7002PggpS表达最强;Zn2+浓度为50 μmol时,诱导型启动子7002smtB-PsmtA有明显诱导表达。（2）根据启动子的强弱结果,分别构建了12个载体,最终得到7株乙醇突变株。其中,2株为诱导型-组成型启动子组合突变株,5株为组成型启动子组合突变株。

论文目录

• 缩写语中英文对照
• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 藻类能源
•     1.1.1 藻类能源的研究背景
•     1.1.2 蓝藻在藻类能源中的优点
•     1.1.3 藻类能源的发展
•   1.2 聚球藻PCC7002
•     1.2.1 聚球藻PCC7002的优点
•     1.2.2 代谢工程在聚球藻PCC7002的应用
•     1.2.3 聚球藻PCC7002产生物乙醇的研究进展
•   1.3 本论文的主要研究目的和内容
• 第2章 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 藻种和菌种
•     2.1.2 藻种的培养
•     2.1.3 实验试剂
•     2.1.4 引物合成
•     2.1.5 培养基和缓冲液的配置
•   2.2 实验仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 聚球藻PCC7002以及集胞藻PCC6803的培养
•     2.3.2 聚球藻PCC7002 DNA的提取
•     2.3.3 集胞藻PCC6803 DNA的提取
•     2.3.4 PCR反应体系
•     2.3.5 PCR产物的纯化与回收
•     2.3.6 感受态细胞DH5α的制备
•     2.3.7 基因克隆
•     2.3.8 载体转化
•     2.3.9 质粒提取
•     2.3.10 质粒转化聚球藻PCC7002
• 第3章 不同启动子在聚球藻Synechococcus sp.PCC7002中表达强度的研究
•   3.1 前言
•     3.1.1 启动子的作用与结构
•     3.1.2 启动子的选择及相关研究现状
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 藻种来源和藻种培养
•     3.2.2 藻类DNA的提取
•     3.2.3 含GFP基因的载体构建
•     3.2.4 藻细胞的转化
•     3.2.5 阳性克隆藻株的鉴定
•     3.2.6 诱导型突变株的培养
•     3.2.7 共聚焦激光扫描显微镜对于GFP荧光的检测
•     3.2.8 流式细胞仪对于GFP荧光的检测
•     3.2.9 酶标仪对于GFP荧光的检测
•   3.3 结果
•     3.3.1 载体构建结果
•     3.3.2 绿色荧光蛋白GFP表达的定性分析
•     3.3.3 绿色荧光蛋白GFP表达的定量分析
•   3.4 讨论
•     3.4.1 组成型启动子的比较
•     3.4.2 诱导型启动子的比较
•   3.5 本章小结
• 第4章 产乙醇载体的构建及其对聚球藻Synechococcus sp.PCC7002的转化
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 藻种、菌种
•     4.2.2 聚球藻PCC7002基因组DNA的提取
•     4.2.3 制备DH5α感受态细胞
•     4.2.4 试剂盒提取质粒
•     4.2.5 琼脂糖凝胶回收
•     4.2.6 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）
•     4.2.7 PCR产物的纯化
•     4.2.8 载体转化感受态细胞
•     4.2.9 转化子大肠杆菌菌落PCR生物验证
•     4.2.10 质粒的酶切
•     4.2.11 基因片段酶切
•     4.2.12 线性质粒与DNA片段的T4连接
•     4.2.13 菌株的保存
•     4.2.14 藻株的保存
•     4.2.15 所用抗生素的配置及分装
•     4.2.16 引物
•     4.2.17 启动子组合载体的构建
•     4.2.18 启动子组合载体的转化
•     4.2.19 突变株的培养和乙醇的检测
•   4.3 结果
•     4.3.1 载体构建结果
•     4.3.2 突变株筛选结果
•     4.3.3 乙醇标准曲线结果
•   4.4 小结
• 第5章 结论与展望
•   5.1 主要结果
•   5.2 论文特色及创新
•   5.3 不足与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郑灵刚

导师: 石拓

关键词: 蓝细菌,聚球藻,启动子,乙醇突变株,代谢工程,合成生物学

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q943.2

总页数: 88

文件大小: 7176K

下载量: 14