中华乌塘鳢LGP2、MDA5和MAVS基因分子克隆及免疫应答分析

论文摘要

中华乌塘鳢（Bostrychus sinensis）是中国一类极富营养价值的经济鱼种,远销港澳等地。但随着人工养殖业的蓬勃发展以及养殖密度的增大,在水体环境中的各类微生物数量增加。当微生物侵染中华乌塘鳢时,会导致产生相关的疾病,影响其养殖业的发展,是生产过程中面临的主要问题。中华乌塘鳢是低等脊椎动物,由于特异性免疫并不发达,依赖先天免疫抵抗微生物入侵。先天免疫系统主要是通过TLRs、NLRs和RLRs三类家族识别病原相关分子模式（PAMPs）发挥免疫应答反应,引起促炎细胞因子以及干扰素的表达。其中RLRs是一类新型的胞内识别病毒的模式识别受体家族,在抗病毒免疫反应中发挥重要的作用。这类家族由三个成员组成,它们分别是LGP2（Laboratory of Genetics and Physiology2）、RIG-I（retinoic acid-inducible gene 1）和MDA5（melanoma differentiation-associated gene 5）。结构上,RIG-I和MDA5蛋白在N末端具有两个串联CARD结构域,可以通过CARD-CARD结构域与定位在线粒体膜上的抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用来激活免疫途径,LGP2缺少CARD结构域,但同样有复杂的调控作用。本研究根据实验室转录组中的已有基因序列,通过PCR克隆得到中华乌塘鳢LGP2、MDA5和MAVS基因,并用生物信息学方法分析其分子特征,利用Real-time PCR方法检测中华乌塘鳢LGP2、MDA5和MAVS基因在poly（I:C）感染后的表达水平变化,推测LGP2、MDA5和MAVS基因在中华乌塘鳢抗病毒免疫中的作用。中华乌塘鳢LGP2基因（BsLGP2）的编码序列为2040 bp,编码679个氨基酸。经预测发现BsLGP2蛋白包括DEXDc、HELICc和RD三个保守的结构域。Real-time PCR实验结果说明BsLGP2基因在健康中华乌塘鳢的10个组织中普遍表达,在头肾中表达量最高,而在肠中表达很低。注射poly（I:C）后除脾脏外的其他免疫器官早期BsLGP2基因表达量明显上调。在外周血中BsLGP2基因表达量持续上调（48 h,约158倍）;BsLGP2基因表达量在头肾和肝脏中的12 h达到峰值（约17倍和约70倍）;而BsLGP2基因在脾脏中早期表达量下调,12 h后表达量迅速上调并在24 h达到最高峰（约1.3倍）。这说明BsLGP2基因可能在先天抗病毒免疫中发挥正调控作用。BsMDA5编码序列为2988 bp,编码995个氨基酸。预测BsMDA5蛋白的结构域是保守的,它们分别是CARDs、DEXDc、HELICc和RD。BsMDA5基因在试验的所有组织中均有表达,在皮肤中表达量最高,其次是外周血,但在肠和脑中表达量很低。相比对照组（PBS）中的BsMDA5基因表达水平变化,在poly（I:C）刺激下的免疫组织中迅速上调,且展现先上升达到峰值后急速下降的趋向。在外周血、头肾和肝脏中BsMDA5在3 h表达量明显上调,在12 h达到最高表达量（约30倍,约3.78倍,约21.78倍）。脾脏中BsMDA5基因表达量在24 h达到峰值（约3.22倍）,说明中华乌塘鳢MDA5基因在先天免疫反应中发挥重要的调控作用。BsMAVS编码序列为2484 bp,编码827个氨基酸。预测发现BsMAVS蛋白包括1个保守的CARD结构域和2段内部重复序列（RPT1）。通过Real-time PCR检测BsMAVS基因在正常中华乌塘鳢组织广泛表达,且在头肾和脾脏中表达量最高,而在肠中具有很低的表达量。在poly（I:C）刺激后的外周血、头肾、脾脏和肝脏中,BsMAVS基因表达量在外周血中迅速且明显上调,并持续表达（48 h,约30倍）;在头肾中BsMAVS基因的表达量在3 h-12 h呈现下调表达,但在12 h后表达量明显上调,并在24 h达到最高峰（约1.3倍）;BsMAVS基因在肝脏中早期表达量上调并达到峰值（3 h,约1.53倍）;脾脏中BsMAVS基因表达量在早期下调,6 h后迅速上升并在12 h达到峰值（约1.2倍）,推测BsMAVS基因在先天免疫应答反应中发挥重要作用。总之,本研究中克隆了中华乌塘鳢LGP2、MDA5和MAVS基因编码序列,初步研究了LGP2、MDA5和MAVS基因的表达分析。研究结果表明BsLGP2可能在先天抗病毒免疫中发挥正调控作用,是RLR抗病毒信号通路中的正调控因子;BsMDA5基因可能参与先天抗病毒免疫应答并发挥重要作用;BsMAVS基因虽缺失TM结构域,但仍在先天抗病毒免疫反应中发挥作用。这为研究中华乌塘鳢RLR信号途径及相关分子机制奠定基础,对中华乌塘鳢疾病的预防和控制起到一定的指导作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 中华乌塘鳢简介
•     1.1.1 形态特征
•     1.1.2 生活习性
•     1.1.3 研究现状
•   1.2 先天免疫模式识别受体种类
•   1.3 RLR家族成员及MAVS基因的结构特征
•   1.4 RLR家族成员识别病毒的特异性
•   1.5 RLR介导的抗病毒信号通路
•   1.6 RLR家族和MAVS在哺乳类的研究
•   1.7 RLR家族和MAVS在鱼类中的研究
•   1.8 选题依据与研究意义
• 第二章 中华乌塘鳢LGP2 基因克隆与表达分析
•   2.1 绪言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 RNA提取与测定
•     2.2.3 cDNA第一链的合成
•     2.2.4 LGP2 基因克隆
•     2.2.5 中华乌塘鳢LGP2 基因生物信息学分析
•     2.2.6 实时荧光定量实验
•   2.3 结果
•     2.3.1 中华乌塘鳢LGP2 基因序列分析
•     2.3.2 LGP2 蛋白结构域比较
•     2.3.3 LGP2 蛋白多序列比对
•     2.3.4 LGP2 蛋白三维结构分析
•     2.3.5 LGP2 基因进化分析
•     2.3.6 正常组织中BsLGP2 基因的表达分析
•     2.3.7 poly（I:C）作用下BsLGP2 基因的时序表达变化
•   2.4 讨论
• 第三章 中华乌塘鳢MDA5 基因克隆与表达分析
•   3.1 绪言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 MDA5 基因克隆
•     3.2.2 中华乌塘鳢MDA5 基因生物信息学分析
•     3.2.3 实时荧光定量实验
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 中华乌塘鳢MDA5 基因克隆
•     3.3.2 BsMDA5 基因序列分析
•     3.3.3 MDA5 蛋白结构域比较
•     3.3.4 MDA5 蛋白多序列比对
•     3.3.5 MDA5 蛋白三维结构分析
•     3.3.6 MDA5 基因进化分析
•     3.3.7 正常组织中BsMDA5 基因的表达分析
•     3.3.8 poly（I:C）刺激后BsMDA5 基因的表达变化
•   3.4 讨论
• 第四章 中华乌塘鳢MAVS基因克隆与表达分析
•   4.1 绪言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 MAVS基因克隆
•     4.2.2 中华乌塘鳢MAVS基因生物信息学分析
•     4.2.3 实时荧光定量实验
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 中华乌塘鳢MAVS基因克隆
•     4.3.2 BsMAVS基因序列分析
•     4.3.3 MAVS蛋白结构域比较
•     4.3.4 MAVS蛋白多序列比对
•     4.3.5 MAVS蛋白三维结构分析
•     4.3.6 MAVS基因进化分析
•     4.3.7 在正常组织中BsMAVS基因的表达分析
•     4.3.8 poly（I:C）刺激下的BsMAVS基因表达时序变化
•   4.4 讨论
• 第五章 总结与展望
•   5.1 研究结论
•   5.2 研究创新点
•   5.3 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文及研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周真真

导师: 张建设

关键词: 中华乌塘鳢,基因克隆,抗病毒免疫

来源: 浙江海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,水产和渔业

单位: 浙江海洋大学

基金: 国家海洋局,公益性行业科研专项201505025

分类号: S917.4;Q78

DOI: 10.27747/d.cnki.gzjhy.2019.000332

总页数: 80

文件大小: 5280K

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