·临床研究·
摘 要：目的探讨高效建立人多能性细胞的方法。方法 利用经典的Yamanaka 方法及Oct4 病毒的重复感染，诱导人皮肤成纤维细胞为诱导的多能性干（iPS）细胞。通过AKP 染色及分化能力，验证其多潜能特性。结果 通过Oct4 病毒的重复感染，将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS 细胞；所建立的iPS 细胞AKP 染色阳性，免疫缺陷裸鼠的皮下获得了含三胚层结构的畸胎瘤。结论 通过Oct4 病毒的重复感染，成功的将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS 细胞。
关键词：成纤维细胞；重编程；诱导多能性干细胞
0 引言
迄今，iPS 技术的广泛应用，可以极大程度上了解疾病的发病机制，为基因靶向治疗和药物筛选提供了强有力的研究工具[1]。目前，由于一些技术问题，人iPS 细胞的重编程效率仍较为底下[2]，那么，如何提高重编程效率，是现今急于攻破的技术难题。
本研究探讨在诱导过程中应用Oct4 病毒的重复感染，重编程人皮肤成纤维细胞为iPS 细胞，为细胞替代治疗及药物筛选等模型的建立奠定基础。
1 资料与方法
1.1 材料。本实验所用的人皮肤成纤维细胞系购于ATCC 公司，ICR 小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。培养基、胎牛血清（FBS）、Oct4，Sox2，c-Myc 和Klf4 四种转录因子的逆转录病毒等试剂均购自Invitrogen 公司。
1.2 方法
1.2.1 供体细胞的选择及逆转录病毒的感染：选取1-3 代皮肤成纤维细胞作为iPS 的供体细胞。选取2-3 代ICR 小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞。按等比例的感染剂量将人源性Oct4、Sox2、c-Myc 、Klf4 四种逆转录病毒液混合加入融合度达 80%的第2 代人皮肤成纤维细胞进行感染，同时加入4mg/L 的聚凝胺（polybrene）以促进病毒粘附。感染24 h 后，换成纤维细胞培养液培养，记为Day0。Day8 后，将其接种在饲养层细胞上，换成用iPS 培养液。通过形态学筛选出典型的克隆，进行传代。传至第3 代后，向培养皿中扁平集落添加Oct4 病毒液进行重复感染。
2.2.2 碱性磷酸酶AKP（alkaline phosphatase）染色：碱性磷酸酶（AKP）检测显示iPS 细胞为碱性磷酸酶阳性，如图2d 所示。
补偿范围：仅对煤电机组进行枯水期备用补偿，是一种歧视性的补偿政策，因为云南在枯水期80%以上的电力来源于水电机组，对于同样提供枯水期备用的有调节能力的机组来说并不公平。从市场的长期公平角度来说，应逐步取消对不同类型机组的政策性补偿，而是按照服务类型对提供枯水期备用服务的所有运行机组进行公平的补偿。
2.2.1 形态学鉴定：我们选取P2 皮肤成纤维细胞作为供体细胞进行诱导，在病毒感染后的Day20，培养皿中开始出现隆起于饲养层细胞表面，高核质比，大核仁，边缘比较整齐的克隆。在传至P3 后，边缘失去了明显的细胞界限，出现易于分化的趋势，随即进行Oct4 病毒液重复感染，克隆恢复了类似于人胚胎干细胞的形态，并能稳定传代。细胞形态演变如图2a-c 所示。
2 结果
2.1 人iPS 细胞的诱导过程。我们应用经典Yamanaka 4 因子的逆转录病毒感染第2 代皮肤成纤维细胞，建立人iPS 细胞，感染24 h 后，换成纤维细胞培养液培养，记为Day0。Day8后，将其接种在饲养层细胞上，换成iPS 培养液培养。连续培养的Day20，我们观察到了类似人胚胎干细胞形态的克隆。机械法分离后，记为第一代P1。传至P3 后，克隆向扁平形态分化，随即加入等比例的Oct4 病毒液进行重复感染。稳定传代后，我们观察到了比较典型的类似人胚胎干细胞形态的克隆。诱导流程如图1 所示。
1.2.2 人iPS 细胞的鉴定：①形态学鉴定：显微镜下观察所建立iPS 细胞形态。②碱性磷酸酶AKP（alkaline phosphatase）染色：选取传至第5 代的iPS 细胞，按照碱性磷酸酶显色试剂盒说明书进行操作（购自Beyotime 公司），显微镜下观察其染色结果。③分化能力的检测：以畸胎瘤的形成检测其体内分化能力。将iPS 细胞接种于免疫缺陷小鼠背部皮下，观察皮下荷瘤情况。6 周后收集肿瘤，以4%多聚甲醛常温固定过夜，石蜡包埋、HE 染色观察是否有三胚层的组织结构。
图1 iPS 细胞诱导流程图
2.2 细胞形态变化及多潜能性鉴定
护理后，护理组患者SAS评分（36.1±11.9）分、SDS评分（35.7±9.3）分；常规组SAS评分（42.9±7.8）分、SDS评分（40.5±12.8）分，组间各数据比较，差异均具有统计学意义（t=3.511 9、2.229 3，P=0.000 7、0.027 9）。
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4.人才不够。各试点省份税务系统公职律师人员普遍不多，且分布不均，一些地市税务系统仍旧没有合格的公职律师人选。此外，部分具备法律专业背景的干部缺乏法律服务工作经验，法律服务的技能和水平还有待提高。
2.2.3 体内分化能力的检测：我们将所建立的P10 人iPS 细胞注射到裸鼠的背部皮下。2 周内可形成畸胎瘤，6 周后取畸胎瘤做组织学检测显示含有所有三个胚层的结构，包括：神经细胞（外胚层），血液（中胚层），假复层纤毛柱状上皮（内胚层），如图2e-h 所示。
图2 iPS 细胞形态及多潜能性鉴定
注：a.P2 皮肤成纤维细胞形态；b.P3iPS 细胞形态；c.Oct4 病毒复感iPS 细胞形态；d.AKP（+）；e.注射iPS 细胞的裸鼠；f.神经细胞（外胚层）；g.血液（中胚层）；h.假复层纤毛柱状上皮（内胚层）；标尺示100 µm。
3 讨论
iPS 技术是一种产生多能性干细胞的新方法，与之前获得多能性细胞不同的是，iPS 技术不破坏胚胎，不违背伦理道德；且诱导分化后可形成多种功能性细胞用于研究[3]。迄今，应用该技术已建立了多种物种的iPS 细胞。该技术已在研究细胞重编程机制、提高重编程诱导效率和供体细胞选择等方面取得了重要的进展[4-5]。
本次研究成功的建立了形态和特征类似于人胚胎干细胞的多能性细胞，并且体外长期传代后仍然保持未分化状态。该成果令人振奋，为今后细胞替代治疗、药物模型筛选的研究奠定了理论基础。同时，今后我们要突破如何提高重编程效率，如何优化培养体系，解决其临床应用的安全性等技术难题。
参考文献
[1] Takahashi K, Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell, 2006, 126(4):663-676.
[2] Biswas D, Peng J. Chemically induced reprogramming of somatic cells to pluripotent stem cells and neural cells[J].Int J Mol Sci,2016,17(2):218-226.
[3] 李雪,单智焱,吴嫣爽,等.人包皮成纤维细胞来源的多能性干细胞的建立[J].解剖学报,2012,43(5):601-607.
[4] 范文娟,马永超,陈旭东,等.维甲酸诱导小鼠iPS 细胞向神经细胞分化[J].神经解剖学杂志,2015,31(1):103-108.
[5] 彭静,黄聪,蒋思文.诱导多潜能干细胞(iPSCs)的临床应用进展[J].科学通报，2014(9):763-768.
中图分类号：R329
文献标识码：A
DOI：10.19613/j.cnki.1671-3141.2019.84.025
本文引用格式：李雪,姚宏波,张犇,等.重编程人皮肤成纤维细胞为iPS 细胞的研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(84):49+53.
基金项目：本文系齐齐哈尔市科技局一般指令项目（项目编号：SFGG-201764）
作者简介：李雪（1984-），女，汉族，黑龙江省齐齐哈尔市，硕士研究生，讲师，研究方向：胚胎干细胞(诱导多能性干细胞）的诱导及分化。
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