微米管表面的CHA放大-竞争抑制策略用于区分单碱基突变

论文摘要

作为遗传信息的主要载体,DNA在生命系统中具有重要的传递信息作用,目前有等温扩增、微阵列、荧光杂交核酸探针、聚合酶链式反应（PCR）等方法可以检测样品中DNA的种类及含量。由于物理和基因疾病的影响,人类DNA序列会发生各种各样的变异导致基因分型,DNA或RNA序列中单碱基变异可能导致严重的生理后果,因此开发新的检测手段用于区分单核苷酸水平上的DNA序列就变得十分重要。我们合理地设计杂交探针,提高杂交探针选择性识别SNV的能力。一个理想的探针可以只与目标链杂交,而不与突变链杂交,为了构建这种程序化的催化信号放大体系,我们在微米管波导检测平台的基础上,将催化harpin探针自组装体系（CHA）与竞争抑制体系结合,对let-7家族中的let-7a、let-7c、let-7e、let-7f进行区分。我们证明了在这种复合体系下miRNA与探针选择性杂交的效率高于单一体系,区分因子提高了10倍左右,检测极限低至15fM。最后,我们使用该体系对胰腺癌、肺癌、卵巢癌和胃癌患者的血清进行直接检测,实验结果表明放大-竞争体系的微米管平台可以灵敏的区分出健康人与病人的血清,并且可以对患者类型进行初步诊断分析,实现便捷高效的大面积筛查。此外,我们还研究了不同手性和空间结构的聚合物形成囊泡之后,对细胞毒性以及相互作用的影响。聚合物囊泡一般是由嵌段共聚物组装而成,近几年以均聚物为自组装原材料的囊泡逐渐吸引人们的视线。均聚物合成路线简单,通过控制均聚物的拓扑结构和手性,可以调节自组囊泡的结构、尺寸、手性,并影响了囊泡的性能包括细胞毒性、粘附性等。我们选取光学活性材料作为单体,合成线型和超支化均聚物,这样形成的聚合物拥有相同的重复单元,除手性和拓扑结构外其他完全一致;形成囊泡后观察它们的细胞毒性以及与生物界面的相互作用。线型聚合物囊泡与超支化聚合物囊泡在细胞毒性方面表现出明显的对映选择性和立体结构依赖性,暗示囊泡构象在调节生物活性中的关键地位,对后续设计新型手性聚合物囊泡具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 SNV检测方法
•     1.2.1 高分辨率熔解曲线分析（HRM）
•     1.2.2 分子信标法（MB）
•     1.2.3 焦磷酸测序法（Pyrosequencing）
•     1.2.4 单链构象异构多态分析技术（SSCP）
•     1.2.5 基因芯片法（GeneChip）
•     1.2.6 等位基因特异性扩增法（AS-PCR）
•     1.2.7 变性高效液相色谱法（DHPLC）
•   1.3 信号放大方法
•     1.3.1 酶催化放大
•     1.3.2 DNA自组装放大
•     1.3.3 纳米材料放大
•   1.4 放大-竞争抑制策略
•   1.5 本论文研究目的及内容
• 第二章 CHA放大-竞争抑制策略区分单碱基突变
•   2.1 引言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 试剂材料
•     2.2.2 氨基双炔微米管制备
•     2.2.3 probe1修饰微米管
•     2.2.4 probe2淬灭微米管
•     2.2.5 在缓冲溶液和血清中检测let-7家族
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.0 放大与竞争探针的检测机理
•     2.3.1 微米管表征
•     2.3.2 探针结构优化
•     2.3.3 单独放大体系与放大-竞争体系对比
•     2.3.4 放大与竞争探针的比例调整
•     2.3.5 区分因子模拟计算
•     2.3.6 专一性和特异选择性
•     2.3.7 血清环境中检测
•     2.3.8 病人血清检测
•   2.4 本章小结
• 第三章 不同手性结构的聚合物囊泡细胞毒性
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 原料和仪器
•     3.2.2 线型聚合物与超支化聚合物的合成
•     3.2.3 制备线型与超支化聚合物自组装囊泡溶液
•     3.2.4 细胞毒性实验
•     3.2.5 细胞内活性氧（ROS）含量检测
•     3.2.6 囊泡与模拟细胞膜的相互作用
•     3.2.7 囊泡表面电荷密度测量
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 线型与超支化聚合物的表征
•     3.3.2 囊泡的表征
•     3.3.3 细胞毒性实验
•     3.3.4 细胞内活性氧（ROS）浓度检测
•     3.3.5 界面相互作用模拟
•     3.3.6 卵磷脂膜厚度测量
•     3.3.7 囊泡表面电荷密度
•   3.4 本章小结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文及取得的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘福宁

导师: 邹纲

关键词: 单碱基突变区分,家族,放大,竞争抑制,手性均聚物囊泡

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国科学技术大学

基金: 国家自然科学基金(No.21574120,No.21774115),中央高校基础研究基金(No.WK2060200025),安徽省杰出青年科技基金(No.1608085J01)

分类号: Q75

总页数: 67

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