2015～2016年中国部分地区猪轮状病毒感染检测及病毒分离与鉴定

论文摘要

猪轮状病毒病是由猪轮状病毒（porcine rotavirus,PoRV）引起的一种以腹泻、呕吐、厌食、脱水为临床症状的急性胃肠炎传染病。猪轮状病毒是导致世界范围内仔猪剧烈腹泻的主要病原之一,给全球养猪业造成巨大的经济损失。猪轮状病毒感染具有潜伏期短、传染性强、流行范围广、发病率高等特征,常与其他细菌、病毒混合感染而使病情加重,导致患病猪群死亡率升高,严重制约了我国养猪业的健康发展。为调查20152016年中国部分地区猪A群轮状病毒（porcine group A rotavirus,GARV）、猪B群轮状病毒（porcine group B rotavirus,GBRV）和猪C群轮状病毒（porcine group C rotavirus,GCRV）的流行情况,本研究利用巢式RT-PCR方法对2015年1月至2016年12月从我国部分地区采集的321份仔猪腹泻病料和42份健康仔猪粪便进行检测分析,结果显示GARV、GBRV、GCRV阳性率分别为44.10%、2.75%和6.61%;将检测为强阳性的腹泻病料,用胰酶处理后接种Vero细胞,进行病毒的传代培养。然后,对产生明显细胞病变（cytopathic effect,CPE）的分离毒株进行了鉴定,命名为HJ-2016,并对分离毒株的VP4、VP6和VP7基因进行测序和分析。结果显示,该分离株为猪A群轮状病毒,基因型为G5P[7]I5。将本试验所分离的GARV HJ-2016株对未采食母乳的2日龄仔猪进行感染试验,利用本研究建立的SYBR GreenⅠ定量RT-PCR方法检测GARV对攻毒仔猪的组织嗜性,以探索其致病性。结果显示,攻毒组仔猪肺脏和回肠组织中猪轮状病毒核酸载量最高,达到104105copies/μL,肠道组织出现明显的病理变化,GARV HJ-2016株有致病性。本研究明确了20152016年中国部分地区猪A群、B群、C群轮状病毒感染情况,分离出一株猪A群轮状病毒HJ-2016,并建立了SYBR GreenⅠ定量RT-PCR方法,初步探讨了HJ-2016毒株的致病性及感染机制,为我国猪A群轮状病毒病的分子生物学特性研究、疫苗开发、致病性和综合防控提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
•   1.1 猪轮状病毒病原学特征
•     1.1.1 病毒形态及分子特征
•     1.1.2 结构蛋白
•     1.1.3 非结构蛋白
•     1.1.4 轮状病毒的分型
•   1.2 猪轮状病毒的诊断方法
•     1.2.1 经典病原诊断方法
•     1.2.2 免疫学诊断方法
•     1.2.3 分子生物学诊断方法
•   1.3 猪轮状病毒流行病学调查进展
•   1.4 猪轮状病毒疫苗研究进展
•   1.5 研究目的及意义
• 2 2015～2016 年中国部分地区猪轮状病毒感染检测
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 样品来源
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 引物合成
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 临床样本处理
•     2.2.2 病毒RNA的提取
•     2.2.3 反转录生成c DNA
•     2.2.4 GARV、GBRV、GCRV目的基因RT-nPCR扩增
•   2.3 结果
•     2.3.1 GARV、GBRV、GCRV目的基因PCR扩增结果
•     2.3.2 腹泻病料与健康粪便中PoRV病原检测结果
•     2.3.3 2015 ～2016 年中国南北方部分地区PoRV的感染检测结果
•     2.3.4 2015 ～2016 年中国6 个地区PoRV的感染检测结果
•     2.3.5 2015 年、2016 年不同年份的PoRV感染检测结果
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 3 猪轮状病毒的分离与鉴定
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 样品来源、细胞
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 仪器设备
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 病料处理
•     3.2.2 引物设计与合成
•     3.2.3 病毒的分离培养
•     3.2.4 病毒的鉴定
•   3.3 结果
•     3.3.1 病毒分离结果
•     3.3.2 巢式RT-PCR检测结果
•     3.3.3 间接免疫荧光鉴定
•     3.3.4 电镜鉴定结果
•     3.3.5 VP4、VP6和VP7 基因的RT-PCR扩增
•     3.3.6 VP4、VP6和VP7 基因重组质粒鉴定
•     3.3.7 VP4、VP6和VP7 基因序列测序结果
•     3.3.8 HJ-2016 分离株VP6 基因遗传进化树分析
•     3.3.9 HJ-2016 分离株VP4和VP7 基因遗传进化树分析
•     3.3.10 TCID50 的测定结果
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 4 GARV实时荧光定量RT-PCR方法的建立
•   4.1 试验材料
•     4.1.1 病毒核酸样品和阳性对照质粒
•     4.1.2 主要试剂和仪器
•     4.1.3 引物设计
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 标准曲线的建立
•     4.2.2 特异性试验
•     4.2.3 敏感性试验
•     4.2.4 重复性试验
•   4.3 结果
•     4.3.1 阳性质粒的PCR鉴定
•     4.3.2 标准曲线的建立
•     4.3.3 特异性、重复性试验结果
•     4.3.4 敏感性试验结果
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 5 猪A群轮状病毒HJ-2016 株致病性试验
•   5.1 试验材料
•     5.1.1 病毒和试验动物
•   5.2 试验方法
•     5.2.1 仔猪分组与攻毒
•     5.2.2 临床症状观察
•     5.2.3 粪便拭子采集及RT-qPCR检测
•     5.2.4 肠道组织病理学检测
•     5.2.5 GARV组织嗜性检测
•   5.3 结果
•     5.3.1 攻毒仔猪的临床症状
•     5.3.2 猪A群轮状病毒感染的病理变化
•     5.3.3 猪A群轮状病毒感染的病理组织学观察
•     5.3.4 临床症状指标变化结果
•     5.3.5 GARV组织嗜性检测结果
•   5.4 讨论
•   5.5 小结
• 6 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 乔成鹏

导师: 孙东波

关键词: 猪轮状病毒,巢式,分离鉴定,荧光定量,致病性

来源: 黑龙江八一农垦大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学

基金: “十三五”国家重点研发计划(2017YFD0501604-5),聚维酮碘预防仔猪腹泻病机制研究和黑龙江八一农垦大学“三纵”科研支持计划-团队支持计划项目(TDJH201804)

分类号: S852.651

总页数: 91

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