降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定

论文摘要

Ⅱ型糖尿病是以胰岛素敏感性降低、外周组织对葡萄糖的利用率降低以及胰岛素抵抗为特征的代谢性疾病,占全球糖尿病的90%以上。Ⅱ型糖尿病的主要病征是高血糖,而长期的高血糖症状会引发各种慢性并发症,这是导致糖尿病患者死亡的主要因素。在Ⅱ型糖尿病患者中,餐后血糖水平是血糖控制的重要指标。为减少餐后高血糖,临床上通常会使用一些合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂（如阿卡波糖和伏格列波糖等）进行治疗,以减缓碳水化合物的消化和延缓葡萄糖的吸收。但临床发现有些患者长期使用合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂会引起一些不良副作用,包括胃肠胀气和腹部绞痛等。因此,开发一些抑制α-葡萄糖苷酶活性的安全生物活性肽和蛋白质至关重要。Aglycin是一种具有降血糖活性的新型生物活性肽,分子量只有3.7 kDa,由37个氨基酸残基组成,其含有三对分子内二硫键,目前仅可以从大豆或豌豆种子中进行提取分离制备,步骤繁琐,回收率低至1-5 mg/100 g干种子,同时比较难避免试剂残留。因此,开发一种高效生产高纯度Aglycin的简单方法并研究其对α-葡萄糖苷酶抑制的降糖活性,无疑具有重大的理论和现实意义。在本研究中,以活性肽Aglycin为研究目标,主要尝试Aglycin在大肠杆菌原核表达体系中的高效表达方式,并以阿卡波糖为对照,检测重组表达Aglycin的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性。基于Trx标签的促溶功能,将Trx蛋白和Aglycin进行连接,构建融合表达载体并实现在大肠杆菌的体内表达,最终成功获得纯度高达95%的Trx-Aglycin重组蛋白,并且蛋白浓度可达300μg/mL,产量约为25 mg/L菌液。基于自组装肽ELK16和18A能在大肠杆菌细胞内进行自聚集的特性,将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接,构建能在体外自剪切的高效表达载体。首先,对含有自组装肽（ELK16/18A）的两种表达载体进行蛋白表达条件和Mxe GyrA内含肽切割效率的优化,然后对这两种载体所获得的Aglycin的产率和纯度进行比较。结果表明,与用自组装肽18A制备的Aglycin的产率（4.50 mg/g菌体湿重）和纯度（95.63%）相比,ELK16具有比18A更好的制备效果,具有更高的产率（5.53 mg/g菌体湿重）和纯度（98.15%）。通过自组装肽（ELK16或18A）重组表达生产的Aglycin的产率比化学提取方法（1-5 mg/100 g干种子）提高了近100倍。因此,采用自组装肽的基因工程手段重组表达Aglycin,工艺简单且产率高,优于化学提取方法。最后,对重组表达得到的Trx-Aglycin蛋白和Aglycin多肽进行了α-葡萄糖苷酶抑制的体外降糖活性检测。经体外实验证明,Trx-Aglycin融合蛋白对α-葡萄糖苷酶活性的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)大约为44.83μmol/L,而Aglycin多肽对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50大约为36.48μmol/L,这比Trx-Aglycin融合蛋白降低了约20%,说明Aglycin多肽比其带Trx融合标签的蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制活性要强。另外,不管是Aglycin多肽还是Trx-Aglycin融合蛋白,均比阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50（990μmol/L）低,说明Aglycin比阿卡波糖有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,这进一步证明Aglycin有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力。本研究主要提供了Aglycin在大肠杆菌中的两种高效表达方式,首次通过基因工程的生物方法实现了Aglycin的重组表达,并且验证其具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制的活性,这为Aglycin开发为降糖多肽药物奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 糖尿病
•     1.2.1 糖尿病的来源及危害
•     1.2.2 糖尿病的治疗—口服降血糖药
•   1.3 降血糖肽研究现状及进展
•     1.3.1 生物活性肽
•     1.3.2 植物多肽类激素—豆类胰岛素
•     1.3.3 降血糖肽
•     1.3.4 降血糖机制
•   1.4 降糖肽Aglycin概述
•     1.4.1 Aglycin的发现及制备
•     1.4.2 Aglycin的降糖功能
•   1.5 多肽的重组表达元件
•     1.5.1 硫氧还蛋白Trx
•     1.5.2 内含肽Mxe GyrA
•     1.5.3 自组装肽ELK16和18A
•   1.6 本课题的研究意义及研究内容
•     1.6.1 研究意义
•     1.6.2 研究内容
•     1.6.3 技术路线
• 第二章 基于Trx标签在大肠杆菌中高效表达Aglycin
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与仪器
•     2.2.1 菌株、载体及引物
•     2.2.2 主要实验仪器设备
•     2.2.3 主要实验试剂
•     2.2.4 常用培养基和实验溶液的配制
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 pET32a-Trx-Aglycin重组表达载体的构建
•     2.3.2 Trx-Aglycin的小量表达及条件优化
•     2.3.3 Trx-Aglycin的大量表达及纯化
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 pET32a-Trx-Aglycin载体的构建结果
•     2.4.2 Trx-Aglycin的表达条件优化
•     2.4.3 Trx-Aglycin的大量表达及纯化结果
•   2.5 本章小结
• 第三章 基于自组装肽在大肠杆菌中高效表达Aglycin
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料与仪器
•     3.2.1 菌株、载体及引物
•     3.2.2 主要实验仪器设备
•     3.2.3 主要实验试剂
•     3.2.4 常用培养基和实验溶液的配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16重组表达载体的构建
•     3.3.2 pET30a-Aglycin-Mxe-PT-18A重组表达载体的构建
•     3.3.3 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的小量表达及条件优化
•     3.3.4 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的大量表达及洗涤优化
•     3.3.5 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的切割条件优化
•     3.3.6 Aglycin多肽的Tricine-SDS-PAGE检测
•     3.3.7 Aglycin多肽的纯化及透析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16载体的构建结果
•     3.4.2 pET30a-Aglycin-Mxe-PT-18A载体的构建结果
•     3.4.3 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的表达条件优化
•     3.4.4 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的大量表达及洗涤优化
•     3.4.5 Aglycin-Mxe-PT-ELK16/18A的切割条件优化
•     3.4.6 Aglycin多肽的Tricine-SDS-PAGE检测结果
•     3.4.7 Aglycin多肽的纯化结果
•     3.4.8 两种融合蛋白聚集体生产Aglycin多肽的产量比较
•   3.5 本章小结
• 第四章 Aglycin的体外降糖活性检测
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料与仪器
•     4.2.1 实验样品
•     4.2.2 主要实验仪器设备
•     4.2.3 主要实验试剂
•     4.2.4 常用实验溶液的配制
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 蛋白及多肽的浓缩及浓度测定
•     4.3.2 PNP标准曲线的绘制
•     4.3.3 Trx-Aglycin及Aglycin多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性检测
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 蛋白及多肽的浓缩及浓度测定结果
•     4.4.2 Trx-Aglycin及Aglycin多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性结果
•   4.5 本章小结
• 结论与展望
•   结论
•   创新性成果
•   展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄敏华

导师: 王菊芳

关键词: 大肠杆菌,硫氧还蛋白,自组装肽,葡萄糖苷酶抑制

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,药学

单位: 华南理工大学

分类号: Q78;R977.15

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.000591

总页数: 97

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