低氧通过激活PI3K/Akt途径抑制活性氧产生调节人牙髓细胞氧化应激状态

论文摘要

研究背景组织再生工程主要的实验手段是将细胞植入到病变环境中来修复损伤组织。由于人牙髓细胞（Human Dental Pulp Cells,hDPCs）具有高增殖,多分化潜能和低免疫原性,被认为是再生医学最有希望的种子细胞来源。然而,移植环境对细胞的条件要求非常严格,且干细胞在体外扩增期间存在有老化、干性缺失一系列问题。因此如何解决这些问题成为再生医学的重大挑战。目前,越来越多的关于细胞移植前体外预处理的研究方案成为解决途径之一。这些实验研究目的都试图改善细胞体外扩增期间的培养微环境,从而促进细胞植入、归巢和生存。其中,低氧预处理（Hypoxic Precondition,HP）是一种运用广泛,直接有效的方法,可促进移植干细胞在体内的存活和分化,而这是干细胞组织再生成功的重要因素。近年来发现低氧在许多生理过程中起重要作用,不同程度的低氧参与不用的生理和病理学行为,比如调节胚胎发育过程中干细胞增殖和分化的信号转导,正常组织细胞中的氧化代谢等等。干细胞在低氧生态位中的重要优点是可以保持细胞的缓慢增殖速率,以及较低的氧化应力刺激。事实上,所有细胞在进行有氧代谢的过程中都能产生活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）,这种过氧化物可破坏DNA稳定性并诱导细胞中的氧化应激反应。同样,细胞对ROS的反应高度依赖于其他因素,例如细胞表型、细胞分化状态或其他刺激状态。总体来讲,低水平的ROS浓度能维持细胞的干性;中度水平的ROS能促进干细胞的分化;而高浓度的ROS则能诱导干细胞的凋亡或者坏死。例如,骨髓腔内未分化的造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells,HSCs）具有比外周血中已分化的造血细胞表达更低水平的ROS,由此可以看出ROS和低氧之间存在某些平衡。生理氧张力在1%至14%之间变化,血运丰富的部位氧浓度越高,反之亦然,都低于体外培养时的氧浓度（211%）。虽然没有具体的人牙髓中生理氧浓度测量的数据,但使用大鼠动物模型的研究发现切牙牙髓组织的氧浓度约为3%。关于低氧对hDPCs中表型变化的研究文献显示,不同的氧浓度刺激hDPCs,细胞的表型变化不同,尤其是在细胞分化、增殖和迁移方面。另一方面,比较统一的研究结果有HP后hDPCs的血管生成能力和外泌体分泌水平以及细胞自噬程度显著增高。究其原因,培养中使用不同氧浓度、细胞代数、培养时间和供体年龄以及不同的操作标准都可能影响低氧实验结果。基于以上的文献基础,我们假设生理氧浓度的HP能够通过降低hDPCs中的氧化应激来维持细胞干性的可能。因此本课题组研究了HP对氧化应激和干细胞特性的影响,并结合生物信息学揭示其可能的作用机制,在此基础上做进一步的验证。找出hDPCs的体外培养最佳优化条件,为其作为种子干细胞应用于组织再生的临床治疗提供更多的实验依据。第一章人牙髓细胞的体外分离、培养和鉴定目的:原代培养hDPCs并行组织来源鉴定。方法:组织块法分离培养人牙髓组织的原代细胞。通过观察培养的细胞形态;流式细胞术检测细胞表面标志物;观测细胞多向分化的能力（成骨、成软骨、成脂）来鉴别所培养细胞的组织来源和生物学特性。结果:培养第7d时即可在倒置显微镜下观察到有散在的hDPCs从组织块边缘爬出,呈放射状生长,约14d后形成环状生长圈。单个细胞呈典型的成纤维样细胞形态,星形或长梭形,胞浆丰富,胞核椭圆居中。待相邻组织块爬出的细胞生长至汇合后消化传代,传代后的hDPCs经过连续培养呈复层生长特性。流式细胞仪检测细胞的表面标志物显示,间充质干细胞标志物CD105、CD44表达率分别为84.31%、87.080%;造血干细胞标志物CD34、CD45表达率分别为0.01%、0.0 02%。多向诱导培养后,细胞向成骨、成软骨及成脂方向分化,相关标志物ALP、Col II、LPL免疫荧光染色（红色）表达阳性。同时通过茜素红、阿尔新蓝和油红染色后,观察到成骨诱导组内细胞有大小不一的矿化结节形成,成软骨组细胞胞外有蓝色的糖胺聚糖形成,成脂诱导组细胞胞浆内有成串或散在脂滴形成。结论:本实验证明通过组织块培养法能有效的在体外进行hDPCs的原代培养,并通过对细胞形态、表面标志物和多向分化能力的观察,判断实验中所培养的细胞来源于间叶组织,并具有较好的体外增殖和多向分化的能力。第二章低氧预处理对人牙髓细胞的增殖和迁移的影响目的:建立低氧预处理模型并探讨其对hDPCs增殖和迁移能力的影响。方法:用3%的低氧培养hDPCs,Western-Blotting验证HIF-1 a的蛋白表达情况。CCK-8法检测低氧组、常氧组和复氧组的细胞增殖能力;流式细胞术检测三组间细胞周期分布的情况;Transwell小室检测三组间迁移能力的差异。结果:低氧刺激hDPCs后细胞内HIF-1 α蛋白表达水平逐渐升高,到24h时达到表达高峰,随后逐渐下降。低氧处理的前期（≤6d）,各组间的增殖差异不明显。当培养时间延长至10d时,低氧组的增殖能力低于常氧组和复氧组,常氧组与复氧组间无明显差异。低氧组内S期细胞比例高于常氧组。低氧组内细胞穿过小室隔膜的数量较常氧组和复氧组低,并呈簇状分布。结论:3%的低氧处理hDPCs是一个比较稳定可靠的预处理模型,为后面的实验提供了较好的实验基础。在此基础上进行的实验发现低氧预处理能降低细胞的增殖能力和迁移能力,使得细胞保持一个”静息”状态,结束预处理后恢复常氧培养并不影响细胞的增殖和迁移能力。第三章低氧预处理对人牙髓细胞干细胞特性的影响目的:探究低氧预处理对hDPCs干细胞特性的影响。方法:不同氧浓度培养后鉴定实验各组细胞的克隆形成能力和细胞形态;流式细胞术检测干细胞表面标志物CD133、CD105、CD34、OCT4的变化;无血清条件培养法观察细胞的成球情况。结果:低氧处理后细胞克隆的形成数目明显大于常氧组和复氧组,细胞克隆数目大小分别为低氧>复氧>常氧。镜下观察可见低氧组内细胞数目明显多于常氧组和复氧组,细胞体积较小,梭形细胞比例较高,培养视野清晰。低氧组干细胞标志物CD133的表达增高,CD34、CD105和OCT4的表达无明显改变。无血清条件培养第1d,各实验组中即能形成少量的细胞球体,但随培养时间延长,细胞球的数目和体积并未有明显增长。结论:本章实验的结果证明,低氧预处理能明显提高hDPCs的克隆形成能力和间充质干细胞表面标志物CD133的表达,在一定程度上能保持了 hDPCs在体外培养时的干细胞特性。第四章低氧预处理对人牙髓细胞抗氧化应激能力的影响目的:探究低氧预处理对hDPCs抗氧化应激能力的影响。方法:不同氧浓度培养后流式细胞术检测细胞内ROS的产生和凋亡比例;Elisa检测培养上清内炎症因子IL-6、IL-1 β的表达情况;WST-1法检测各组培养上清液中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的表达情况。结果:低氧组ROS活性和细胞凋亡比例最低,复氧组介于低氧和常氧之间。各组间的炎症细胞因子IL-6、IL-1β的表达无明显的统计学差异。在各组间抗氧化酶CAT和SOD的表达没有明显的差异性,GSH-Px的组间差异明显。其中低氧组内的GSH-Px明显高于常氧组和复氧组。结论:证明3%低氧预处理hDPCs能降低细胞ROS的释放,减少细胞凋亡的比例,同时提高抗氧化酶GSH-Px的表达,有效的降低细胞受到的氧化应激压力。第五章低氧预处理对人牙髓细胞氧化应激状态的机制研究目的:探索低氧预处理调节hDPCs氧化应激能力的机制。方法:RNA-seq分析不同氧处理48h后两组内的差异基因表达谱,筛选出可能调控氧化应激的富集通路,Western-Blotting验证不同氧条件+抑制剂处理后通路关键蛋白pPI3K的表达情况。CCK-8检测实验各组细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞ROS的表达和细胞凋亡比例;Elisa检测各组培养上清内炎症因子IL-6、IL-I1β的表达情况;WST-1法检测各组培养上清液中抗氧化酶SOD,CAT,GSH-Px的表达情况;Western-Blotting验证实验各组蛋白p-PI3K、p-Akt、HIF-1 α、Caspase3、FOXO1的表达情况。结果:全转录组RNA-seq分析结果显示有1,271个基因表达上调和559个基因表达下降。经过聚类分析后显示在生物学过程、细胞组成成分以及分子功能方面差异基因富集,包括细胞的代谢方式中糖酵解的增多,跨膜转运蛋白活性增高以及细胞跨膜离子通道打开等等。使用ToppGene工具进行了进一步分析显示,低氧中下调的基因包括蛋白质合成和代谢途径的富集。PI3K/Akt信号传导途径也在低氧条件下有32个基因被激活,12个基因被下调。进一步验证低氧处理后细胞内磷酸化Akt的表达较常氧组和空白组上升。低氧+LY294002实验组的增殖活力最低。低氧状态下两实验组的ROS表达与常氧组相比均有所下降,其中低氧空白组ROS表达最低,常氧组组内无差异。低氧空白组组内的细胞凋亡比例最低,常氧+LY294002实验组内的细胞凋亡比例最高。实验各组细胞上清中炎症细胞因子IL-6、IL-1β的表达无明显的统计学差异。抗氧化酶CAT和SOD的表达在各组间无差异性,低氧空白组上清内GSH-Px的表达高于低氧+LY294002组。与常氧组相比,低氧组磷酸化PI3K、Akt和HIF-1 α的表达增高。NAC组和空白组内各目标蛋白的表达一致,同时H202和LY294002组的表达一致,NAC组和对照组内的磷酸化PI3K和Akt水平高于H202组和LY294002组。HIF-1 α和PI3K/Akt通路的下游蛋白Caspase 3、FOXO1的表达相同,但与p-PI3K和p-Akt的表达相反。结论:本章实验证明低氧状态下hDPCs的分子机制发生变化,与低氧相关的一系列途径被激活,其中与氧化应激调节相关的PI3K/Akt途径关键蛋白表达上升。加入通路抑制剂LY294002可以降低细胞的增殖能力,增加细胞内ROS的释放和凋亡细胞的比例,降低抗氧化酶GSH-Px的表达。低氧处理后的hDPCs内PI3K/Akt信号传导增多并逆向调节下游蛋白FOXO1和Caspase3的表达来影响细胞内ROS产生,证明低氧通过激活PI3K/Akt途径抑制活性氧产生调节人牙髓细胞氧化应激状态。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 人牙髓细胞的体外分离、培养和鉴定
•   1 材料与方法
•   2 结果
•   3 讨论
• 第二章 低氧预处理对人牙髓细胞的增殖和迁移的影响
•   1 材料与方法
•   2 结果
•   3 讨论
• 第三章 低氧预处理对人牙髓细胞干细胞特性的影响
•   1 材料与方法
•   2 结果
•   3 讨论
• 第四章 低氧预处理对人牙髓细胞抗氧化应激能力的影响
•   1 材料与方法
•   2 结果
•   3 讨论
• 第五章 低氧预处理对人牙髓细胞氧化应激状态的机制研究
•   1 材料与方法
•   2 结果
•   3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 缩略词表
• 成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘斐

导师: 吴补领,陈婷

关键词: 低氧,人牙髓细胞,干细胞特性,氧化应激

来源: 南方医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 南方医科大学

分类号: R329.2

总页数: 112

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