OmpR-LrhA渗透压响应信号系统反向调控骆驼刺泛菌生物膜和运动性的机制研究

论文摘要

在自然界中,细菌采用多种适应性策略或手段来应对不断变化的环境。值得注意的是,大多数细菌在响应环境变化的过程中出现两种不同的生长方式:浮游模式和生物膜模式。生物膜的形成由多种因素控制,这些因素是细菌从浮游状态到生物膜状态转换过程中的重要参与者,目前已发现多种调控因子和分子开关具有调控菌体从浮游状态至生物膜状态转换的功能。这些调控因子和分子开关联合复杂的调控网络可以响应各种环境信号从而控制细菌自身生活方式的转换,进一步影响植物或者宿主的生长,但对其内在调控机制的了解极为有限。环境渗透压对于细菌的生长和存活至关重要,尽管目前已经从不同细菌中鉴定到多个响应环境渗透压调节的调控因子,但渗透压变化如何影响细菌运动性、生物膜形成和对宿主的定殖所知甚少。本研究中我们在骆驼刺泛菌中发现了一个OmpR-LrhA渗透压响应信号级联系统,可反向调控骆驼刺泛菌的生物膜和运动性,并影响细菌对宿主植物的定殖,从而为该领域的研究带来了新的认识。LrhA是LysR家族的一种转录调节蛋白,其同源蛋白在不同细菌中被命名为HexA、PecT和RovM等,在不同细菌（变形杆菌、大肠杆菌、耶尔森氏菌等）中发挥多样化的功能,如在细菌运动性、生物膜形成、致病性、耐药性等方面发挥重要作用。本文以具有抗旱促生功能的植物内生细菌骆驼刺泛菌（Pantoea alhagi LTYR-11Z）为研究对象,利用分子生物学手段,研究LrhA的生理生化功能,揭示其在调控细菌生物膜形成、运动性、植物定殖等方面扮演的角色,取得以下研究成果:（1）在P.alhagi LTYR-11Z中,LrhA可以正向调节生物膜的形成,负向调节细菌泳动的能力;通过小麦吸附和定殖实验检测到:在不同时间点,lrhA基因的缺失明显降低了细菌对小麦的吸附和定殖能力,通过共聚焦显微镜更直观的观察到野生型和lrhA突变体之间这种能力的差异。说明该基因可能作为一种重要的植物定殖调节因子,影响细菌对植物的吸附和定殖。（2）通过转录组数据和qRT-PCR分析发现,LrhA对eps起正向调节的作用,对flhDC起反向调节的作用。进一步通过刚果红定性以及胞外多糖（EPS）定量检测发现LrhA可以增加EPS的合成量并影响生物膜形成,使用lacZ报告基因检测野生型菌株和lrhA突变体中的eps的表达差异,进一步明确了LrhA对eps在转录水平的正向调控,凝胶迁移阻滞实验（EMSA）验证了LrhA可以直接与eps启动子上游的一段序列特异结合,正向调控EPS的表达,进而影响生物膜的形成。同样,我们发现lrhA可以逆向调节flhDC启动子的活性,在转录水平上负向调节flhDC的表达。EMSA实验检测LrhA和flhDC启动子之间存在特异性的结合,细菌泳动实验进一步验证了LrhA通过对flhDC的负向调节来影响细菌的运动性。（3）构建了opgGH启动子与lacZ报告基因的融合报告菌株,并检测opgGH启动子的活性,发现LrhA正向调节opgGH启动子的转录活性,而且发现LrhA和opgGH启动子之间存在特异结合,并发现opgGH在正向调控生物膜和负向调控细菌运动性方面起到重要的作用。此外,我们发现敲除lrhA的菌株与野生型菌株（WT）相比,OPGs的含量明显降低,从而表明LrhA可正向调节opgGH启动子的表达,进而影响菌株中OPGs的含量。（4）利用蛋白印迹法发现,分别敲除基因opgH和lrhA后,磷酸化的RcsB蛋白水平均明显降低,但在缺失lrhA的菌株中回补opgGH后,该菌株的磷酸化RcsB蛋白表达量又可以恢复至较高的水平,从而证实OPGs浓度的增高可以激活细菌内部的Rcs磷酸化通路。此外发现OPGs/OpgGH在P.alhagi中通过调控RcsB的磷酸化水平来调节eps和flhDC的转录活性,进而调节生物膜的形成和细菌的运动性,而lrhA的表达同时又被激活的Rcs磷酸化系统反馈抑制。（5）通过Real-time PCR发现:随着NaCl和山梨醇浓度的提高,lrhA、opgG和opgH的mRNA水平呈不同程度的增多趋势,eps和opgGH的启动子活性大幅度提高,flhDC启动子活性降低。但缺失基因lrhA后,菌株不再响应外界渗透压的变化。以上结果提示,lrhA在调节eps、flhDC和opgGH的过程中,要受到环境渗透压的调节。同样,随着NaCl和山梨醇浓度的提高,野生型菌株的生物膜生成量增多,细菌的泳动能力降低,植物定殖能力增强;但是,在缺失lrhA以后,无论渗透压如何变化,生物膜的形成、泳动实验、根部定殖等无明显改变。（6）利用生物信息学分析了lrhA启动子区域与OmpR可能的结合位点,使用lacZ报告基因检测野生型菌株和ΔompR中的lrhA的表达差异,进一步明确OmpR对lrhA的正向调控,EMSA实验发现OmpR可以直接与lrhA启动子上游的一段序列特异结合。此外,验证了OmpR通过响应环境渗透压的变化调控lrhA的表达。基于这些结果,本文提出了相应的动态模型:OmpR-LrhA响应周围环境中的渗透压变化,通过级联反应调节eps,flhDC和opgGH启动子的表达,进而控制细菌浮游/生物膜方式的转变。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 植物内生菌概述
•     1.1.1 植物内生菌的定义和起源
•     1.1.2 植物内生菌的多样化
•     1.1.3 植物内生菌的作用
•     1.1.4 骆驼刺及骆驼刺内生菌的研究进展
•   1.2 生物膜概述
•     1.2.1 胞外蛋白质
•     1.2.2 多糖
•     1.2.3 细胞外DNA
•     1.2.4 脂质
•     1.2.5 生物膜的形成过程
•     1.2.6 生物膜形成的调控机制
•   1.3 细菌的运动性及调控
•   1.4 LrhA基因的功能简述
•     1.4.1 LrhA的简介
•     1.4.2 LrhA对运动性的调控
•     1.4.3 对Sigma因子RpoS稳定性的调节
•     1.4.4 LrhA的自我调节
•   1.5 渗透调节周质葡聚糖（OPGs）
•     1.5.1 OPGs的合成
•     1.5.2 OPGs合成的调控
•     1.5.3 OPGs的生物学功能
•   1.6 OmpR基因的功能简述
•     1.6.1 OmpR是一种多向调节蛋白
•     1.6.2 EnvZ/OmpR系统的组成成分
•     1.6.3 OmpR和 CpxR之间存在着竞争
•   1.7 RcsCDB
•   1.8 选题依据和目的意义
•   1.9 技术路线
• 第二章 LrhA对骆驼刺泛菌生物膜、运动性和定殖的调控作用
•   2.1 引言
•   2.2 材料和方法
•     2.2.1 主要试剂
•     2.2.2 培养条件
•     2.2.3 菌株和质粒
•     2.2.4 所用引物
•     2.2.5 实验仪器
•     2.2.6 P.alhagi LTYR-11Z总基因组DNA提取
•     2.2.7 PCR反应
•     2.2.8 质粒提取及回收
•     2.2.9 酶切及连接体系
•     2.2.10 大肠杆菌感受态的制备及热激转化
•     2.2.11 P.alhagi LTYR-11Z电转感受态制备与电转
•     2.2.12 P.alhagi LTYR-11Z突变体的构建
•     2.2.13 互补菌株的构建
•     2.2.14 生物膜形成能力的检测
•     2.2.15 泳动实验的定性及定量检测
•     2.2.16 细菌生长能力的定量检测
•     2.2.17 小麦定殖实验的检测
•   2.3 结果
•     2.3.1 ΔlrhA对生物膜形成能力的影响
•     2.3.2 ΔlrhA对细菌运动能力的影响
•     2.3.3 ΔlrhA对细菌生长特性的影响
•     2.3.4 ΔlrhA对细菌定殖能力的检测
•   2.4 讨论和结论
• 第三章 LrhA通过eps、flhDC操纵子调控骆驼刺泛菌生物膜形成和运动性
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 主要试剂
•     3.2.2 培养基与试剂
•     3.2.3 菌株和质粒
•     3.2.4 所用引物
•     3.2.5 实验仪器
•     3.2.6 刚果红培养基中EPS定性检测
•     3.2.7 EPS的定量检测
•     3.2.8 LrhA蛋白的表达与纯化
•     3.2.9 β-gal酶活性的检测
•     3.2.10 凝胶电泳迁移检测
•     3.2.11 转录组测序及其余实验方法
•   3.3 结果
•     3.3.1 lrhA调节相关基因的转录组数据分析
•     3.3.2 lrhA调节相关基因的核酸水平检测
•     3.3.3 LrhA通过正向调节eps的表达而影响生物膜的形成
•     3.3.4 LrhA通过抑制flhDC的表达而影响细菌的运动能力
•   3.4 讨论和结论
• 第四章 LrhA通过调控OPGs的合成影响骆驼刺泛菌生物膜的形成和运动性
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 主要试剂
•     4.2.2 培养基
•     4.2.3 菌株和质粒
•     4.2.4 所用引物
•     4.2.5 实验仪器
•     4.2.6 蛋白印迹法检测
•     4.2.7 OPGs浓度的检测
•   4.3 结果
•     4.3.1 检测LrhA通过对opgGH调节影响细菌的运动性和生物膜的形成
•     4.3.2 OPGs通过对RcsB的磷酸化来影响细菌的运动性和生物膜的形成
•     4.3.3 RcsCDB磷酸化对lrhA和 opgGH的调节研究
•   4.4 讨论和结论
• 第五章 LrhA响应环境渗透压调控骆驼刺泛菌的生物膜、运动性和定殖能力
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 主要试剂
•     5.2.2 培养基
•     5.2.3 菌株和质粒
•     5.2.4 所用引物
•     5.2.5 实验仪器
•     5.2.6 实时定量PCR
•     5.2.7 其余方法
•   5.3 结果
•     5.3.1 LrhA响应环境渗透压的变化
•     5.3.2 LrhA通过响应环境渗透压变化对eps和 flhDC的调节
•     5.3.3 环境渗透压对opgG和 opgH的影响
•     5.3.4 LrhA响应环境渗透压调控生物膜、运动能力和植物定殖能力
•     5.3.5 环境渗透压对细菌生长速度的影响
•   5.4 讨论与结论
• 第六章 OmpR响应环境渗透压调控lrhA基因的表达
•   6.1 引言
•   6.2 材料与方法
•     6.2.1 主要试剂和配方
•     6.2.2 培养基
•     6.2.3 菌株和质粒
•     6.2.4 所用引物
•     6.2.5 实验仪器
•     6.2.6 实验方法
•   6.3 结果
•     6.3.1 lrhA启动子区生物信息学分析
•     6.3.2 OmpR对 lrhA的调节研究
•     6.3.3 OmpR响应不同渗透压变化调节lrhA的表达
•   6.4 讨论与结论
• 第七章 结论与创新点
•   7.1 结论
•   7.2 创新点及展望
•   7.3 模式图
• 参考文献
• 附录
•   1.PCR反应体系
•   2.酶切及连接体系
•   3.小麦定殖实验检测
•   4.试剂配方（部分）
•   5.部分实验仪器
•   6.Phos-tag复合SDS-PAGE凝胶的配制（需现配）
•   7.反转录体系及qRT-PCR反应体系
•   8.本论文所用菌株和质粒
•   9.本文涉及中英文缩略词
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 梁宏

导师: 王瑶,张磊

关键词: 骆驼刺泛菌,生物膜,运动性,植物定殖

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然基金(编号:31671292)

分类号: Q93

DOI: 10.27409/d.cnki.gxbnu.2019.000092

总页数: 115

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