寡孢节丛孢Pex3p等过氧化物酶体相关蛋白功能初步研究

论文摘要

过氧化物酶体（Peroxisome）是一类重要的细胞器,含有多种生化反应的关键酶,参与过氧化氢代谢、脂肪酸β-代谢和乙醛酸循环等多种重要的生物学代谢过程。在真菌中已经报道有多种蛋白质参与过氧化物酶体的生物合成,这些蛋白称为Peroxins,编码这些蛋白的基因称为PEX,所对应蛋白则为Pexp。Peroxins主要有基质蛋白和膜蛋白,其中Pex3p、Pexl6p和Pex19p参与过氧化物酶体膜蛋白的合成和转运以及定位。同时,过氧化物酶体也是脂肪酸代谢的场所,其中过氧化物酶体多功能氧化蛋白（Peroxisomal β-oxidation multifunctional protein,MFP）就在其中起着重要的作用,它的编码基因则为Mfp。寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）是研究捕食线虫真菌与线虫相互作用的代表菌株,它在捕食线虫的过程中产生三维菌网捕器捕捉和侵染线虫。本论文选取寡孢节丛孢中与过氧化物酶体膜蛋白合成相关基因PEX3（AOL<sub>s00215g610）、PEX16（AOL<sub>s00007g540）和PEX19（AOLs00188g3）;同时选择了编码MFP蛋白的两个基因Mfp1（AOL<sub>s00054g29）和Mfp2（AOL<sub>s00076g393）作为研究对象,探究其在寡孢节丛孢的生长发育、抗逆性、产孢和捕食线虫等过程中所起到的作用。主要研究结果1.过氧化物酶体膜蛋白及MFP保守结构域、理化性质和聚类分析通过保守结构域分析表明,寡孢节丛孢中Pexp蛋白家族中,Pex3蛋白含有Peroxin-3（IPR006966）保守结构域;Pex16蛋白含有Pex16（IPR013919）保守结构域;Pexl9蛋白有含有Pex19 protein（IPR006708）保守结构域。而MFP蛋白家族中,两个MFP蛋白都具有HotDog超家族结构域（IPR029069）和参与单胺氧化酶合成的MaoC-like脱水酶的功能位点（IPR002539）,除此之外MFP1还含有短链脱氢还原酶功能位点（IPR002347）和NADP结合的超家族结构域（IPR036291）。另外,分别对Pexp和MFP的分子量和等电点进行了预测,Pexp家族中,Pex3p含有454个氨基酸残基,分子量为50.7kDa,Pex16p和Pex19p的氨基酸残基数目和分子量较小,三者等电点差异都比较大。MFP家族中,MFP1和MFP2的氨基酸残基数目和分子量差异很大,氨基酸数目分别为901和313,分子量则分别是96.3 kDa和34.3 kDa,两者的等电点差异较小,分别为8.1与9.54。在聚类分析中,Pexp系统发育树含有三个主要的分支,而Pex3、16和19蛋白位于这三个不同的分支上。MFP系统发育树含有两个主要分支,MFP1和MFP2也分别位于两个不同的分支上。2.Pex膜蛋白和MFP编码基因的敲除和相关表型特征比较利用同源重组的方法,成功将三个膜蛋白合成相关基因（PEX3,PEX16和PEX19）和两个参与脂肪酸代谢的MFP基因（Mfp1和Mfp2）敲除。除Mfp2外,每个基因均获得了两个以上的转化子。在表型实验中发现敲除了PE 三个膜蛋基因之后,敲除株都不能产生孢子,也不能产生捕器,突变株的杀线虫能力极大的降低;同时突变株营养菌丝生长的速度变慢,菌丝出现不同程度的弯曲,且一定程度变细,隔间距对比野生型变短;此外,突变株对脂肪酸的利用能力也出现了下降;抗逆性实验结果表明,突变株的抗氧化性和抗细胞壁合成能力与野生型有一定的差异。而△MFP敲除株中,△Mfp2在脂肪酸利用能力上出现了一定程度的降低,其他抗逆性实验表型和野生型差异不大;产孢能力上,△Mfp1产孢数目略微下降,△Mfp2产孢数量则稍许增加;孢子萌发速率△Mfp1无明显差异,△Mfp2在4 h和8 h略微滞后于野生型;杀线虫能力无明显差异。本论文的创新点1.成功敲除PEX三个膜蛋白基因和MFP两个基因,并发现PEX三个膜蛋白基因参与了寡孢节丛孢的生长、产孢和杀线虫等重要的生物学过程的调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 捕食线虫真菌和过氧化物酶体相关蛋白的研究进展
•   1 捕食线虫真菌相关研究
•     1.1 线虫危害及相关防治措施
•     1.2 捕食线虫真菌的分类及侵染线虫机制
•   2 过氧化物酶体的相关研究
•     2.1 丝状真菌中过氧化物酶体的相关研究
•     2.2 过氧化物酶体与真菌致病性的相关研究
•     2.3 过氧化物酶体相关基因的种类及功能
•     2.4 与过氧化物酶体膜形成相关的PEX3、PEX16和PEX19
•   3 过氧化物酶体与真菌的脂肪酸β-氧化相关性研究
•   4 本论文研究意义
• 第二章 寡孢节丛孢过氧化物酶体蛋白的序列特征及聚类分析
•   1 前言
•   2 材料与方法
•     2.1 Pex膜蛋白和MFP序列的获取
•     2.2 Pex膜蛋白和MFP功能结构域分析
•     2.3 Pex膜蛋白和MFP蛋白系统发育分析
•   3 结果
•     3.1 Pex膜蛋白保守结构域和系统发育分析
•     3.2 MFP蛋白保守结构域和系统发育分析
•   4 讨论
• 第三章 PEX3、PEX16、PEX19及两个Mfp基因敲除及验证
•   1 前言
•   2 实验材料及仪器
•     2.1 所选菌株及质粒
•     2.2 所用主要溶液和培养基配方
•     2.3 主要仪器及设备
•   3 实验方法
•     3.1 敲除引物设计
•     3.2 提取寡孢节丛孢的基因组并获取上下游片段
•     3.3 质粒pSCN44及pRS426的提取
•     3.4 对pRS426质粒进行双酶切
•     3.5 酵母感受态的制备
•     3.6 酵母感受态的电转
•     3.7 酵母质粒的提取
•     3.8 阳性酵母转化子验证并获得靶基因全长片段
•     3.9 寡孢节丛孢原生质体的制备及转化
•     3.10 寡孢节丛孢转化子筛选
•     3.11 Southern blot进一步验证转化子
•   4 实验结果
•     4.1 三个PEX基因和两个Mfp基因上下游同源片段扩增
•     4.2 电转酵母长出转化子
•     4.3 酵母转化子质粒提取及阳性结果
•     4.4 原生质体化转后转化子验证结果
•     4.5 Southern blot验证结果
•   5 讨论小结
•     5.1 敲除载体的构建
•     5.2 原生质体的制备与转化
•     5.3 敲除转化子的验证
•   6 章节小结
• 第四章 过氧化物酶体膜蛋白基因及Mfp敲除株与野生型表型比较
•   1 前言
•   2 实验材料及所需仪器
•     2.1 实验菌株
•     2.2 培养基及配方
•     2.3 主要药品
•     2.4 主要设备及仪器
•   3 实验方法
•     3.1 生长速率的比较
•     3.2 抗逆性比较
•     3.3 脂肪酸利用
•     3.4 菌丝染色形态比较
•     3.5 产孢数量统计
•     3.6 孢子萌发比较
•     3.7 孢子梗的侧拍
•     3.8 杀线虫能力及捕器产生情况比较
•   4 表型实验结果
•     4.1 △PEX基因敲除株与寡孢节丛孢生长速率比较
•     4.2 △PEX敲除株与野生型相关抗逆性检测
•     4.3 △PEX突变菌株与野生型对脂肪酸利用情况
•     4.4 △PEX突变株及野生型菌丝荧光染色后形态特征
•     4.5 △PEX突变株和野生型产孢情况
•     4.6 △PEX敲除株和野生型孢子梗形态
•     4.7 △PEX敲除株和野生型捕器产生和线虫致死率比较
•     4.8 △Mfp突变菌株与寡孢节丛孢生长速率比较
•     4.9 △Mfp突变株与野生型相关抗逆性检测
•     4.10 △Mfp突变菌株与野生型对脂肪酸利用情况
•     4.11 △Mfp突变株和野生型产孢数量和萌发情况
•     4.12 △Mfp突变株和野生型菌株孢子梗情况
•     4.13 △Mfp突变株和野生型菌株杀线虫及捕器产生情况
•   5 本章小结
• 全文总结及问题讨论
• 参考文献
• 附录
•   附录Ⅰ 论文中使用的质粒图谱
•   附录Ⅱ 论文中使用的缩写及中英文对照
•   附录Ⅲ 研究生在读期间参与发表的论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李青

导师: 张克勤,杨金奎

关键词: 寡孢节丛孢,过氧化物酶体合成蛋白,捕食器官,表型,脂肪酸利用

来源: 云南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 云南大学

基金: NSFC-云南联合基金重点项目:捕食线虫真菌形成捕食器官的信号调控机制研究(项目编号:U1402265)

分类号: Q936

总页数: 95

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