基于基因组和转录组分析的Bacillus megaterium BM2的形态学研究

论文摘要

巨大芽孢杆菌（Bacillusmegateium）,芽孢杆菌属,为革兰氏阳性菌,形体细长,相比其他微生物比较大,菌落形态规则,呈圆形,表面圆润无褶皱,上有凸起。巨大芽孢杆菌因其具有营养要求低等优点,现已广泛的被应用于工业与学术研究领域,包括微生物肥料、生物的防治、畜牧业、水体的净化和蛋白表达上的研究与应用。在巨大芽孢杆菌的应用领域,发酵生物量低、生产成本高一直是限制其大规模应用的瓶颈。课题组前期在造纸黑液池中分离到的一株菌体形态小、发酵密度明显提高数倍的巨大芽孢杆菌B.megaterium BM2,通过与其它标准巨大菌株进行发酵比较,发现其菌体形态大小与所产芽孢的大小均比标准菌株小,因此猜测其具有较高的发酵密度与菌体的形态有关。该菌株的优势使其在异源表达和微生物菌剂方面具有巨大的应用潜力。本论文针对形态学和芽孢形成相关基因进行研究。首先对其进行全基因组测序,通过基因组和比较基因组分析初步找出了BM2菌株中可能与形态有关的基因,包括特有的壁磷壁酸合成有关基因（1751、1752）和与脂磷壁酸合成相关基因（/tasa、ltasb、ltasB）以及棒状结构蛋白MreB。利用温度敏感型敲除载体pKVM1构建敲除载体,通过对转化方法进行探索,确定了利用E.coli S17-1接合转移,插入失活的原理进行基因敲除的敲除体系。随后对筛选出的形态相关基因1751、1752、ltasa、ltasb、ltasB和mreB进行基因敲除,构建了一系列与形态有关的单个（B.megaterium BM2/Δ1751、B.megaterium BM2/Δ1752、B.megaterium BM2/Δ/ltasa、B.megaterium BM2/Δltasb、B.megaterium BM2/AltasB、B.megaterium BM2/ΔmreB）或多个敲除突变体（B.megaterium BM2/Δ1751Δ1752、B.megaterium BM2/ΔltasBΔltasb）,并通过生长验证观察其生理变化,利用电镜技术观察其形态变化,以确定这些基因对菌体生长、细胞壁形成及菌体形态的影响。通过对各个敲除菌株进行生理生化和形态分析,我们发现基因1751、1752、ltasa、ltasd、ltasB的单个或者多个缺失会造成菌体生长变慢,而mreB基因的缺失使得菌株在发酵培养基的生物量提高。在细胞形态上,通过扫描电镜可以看出上述基因的缺失在不同程度上影响了细胞大小和形状,如磷壁酸合成相关基因的缺失会使得对数生长期的细胞变大（ltas）或者变小（17511、1752）,mreB基因的缺失使得芽孢的生成受到严重抑制,并且细胞形态出现方形或者球状。另外,TEM和Western Blot实验均表明上述基因的丢失会引起细胞壁成分的改变,这也是引起生长和形态发生变化的可能原因之一。这些发现说明了我们初步筛选出的与形态有关的基因对菌体的生长及细胞大小有一定的影响,并且有的基因与芽孢形成相关。最后通过转录组分析B.megaterium BM2在生长周期中的基因表达水平变化。一方面在基因表达水平上验证了本论文中筛选出的形态相关基因的表达量差异;另一方面为进一步探索与细胞形态和芽孢形成相关的其它基因提供数据支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）
•     1.1.1 巨大芽孢杆菌简介
•     1.1.2 巨大芽孢杆菌的用途
•   1.2 微生物基因组学概述
•   1.3 转录组学概述
•   1.4 磷壁酸简述
•   1.5 基因敲除体系
•   1.6 本论文研究的思路及意义
• 第二章 B.megaterium BM2基因组分析
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验菌株
•     2.1.2 试剂与仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 基因组测序
•     2.2.2 细菌完成图组装
•     2.2.3 生物信息分析流程
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 进化树分析
•     2.3.2 基因组完成图
•     2.3.3 基因组结构
•     2.3.4 基因功能分析
•     2.3.5 共有基因和特有基因分析
•     2.3.6 形态相关基因的筛选
•   2.4 本章小结
• 第三章 B.megaterium BM2敲除体系建立及磷壁酸合成相关基因的功能验证
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株和质粒
•     3.1.2 培养基及试剂
•     3.1.3 实验所需仪器设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 敲除体系的建立
•     3.2.2 磷壁酸合成相关基因敲除引物设计
•     3.2.3 B.megaterium BM2基因组的提取
•     3.2.4 E.coli S17-1感受态细胞的制备
•     3.2.5 磷壁酸合成相关基因敲除载体的构建
•     3.2.6 双亲杂交方法对磷壁酸合成相关基因进行敲除
•     3.2.7 敲除菌株的生长验证
•     3.2.8 利用电子显微镜观察敲除菌株与原始菌株的细胞形态
•     3.2.9 Western blot分析细胞壁中脂磷壁酸（LTA）含量
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 基因敲除体系的确定
•     3.3.2 特有基因1751和1752敲除载体构建结果验证电泳图
•     3.3.3 特有壁磷壁酸合成蛋白敲除验证电泳图
•     3.3.4 壁磷壁酸合成有关基因敲除菌株的生长验证
•     3.3.5 电子显微镜观察壁磷壁酸合成有关基因敲除后的影响
•     3.3.6 LTA合成相关基因敲除载体构建结果
•     3.3.7 LTA合成相关基因敲除结果验证
•     3.3.8 脂磷壁酸合成相关基因敲除菌株的生长验证
•     3.3.9 电子显微镜观察脂磷壁酸合成相关基因敲除菌株的形态变化
•     3.3.10 Western blot分析结果
•   3.4 本章小结
• 第四章 形态相关蛋白MreB的敲除及功能验证
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 菌株和质粒
•     4.1.2 培养基与试剂
•     4.1.3 仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 敲除引物设计
•     4.2.2 B.megaterium BM2基因组的提取
•     4.2.3 E.coli S17-1感受态细胞的制备
•     4.2.4 基因敲除供体菌E. coli S17-1/pKVM1-mreB的构建
•     4.2.5 双亲杂交方法对mreB进行敲除
•     4.2.6 MreB敲除菌株的生长验证
•     4.2.7 电子显微镜观察菌株B.megaterium BM2/ΔmreB细胞形态
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 基因敲除载体构建结果
•     4.3.2 基因mreB敲除结果验证
•     4.3.3 B.megaterium BM2/AmreB生长验证
•     4.3.4 电子显微镜观察B.megaterium BM2/ΔmreB形态变化
•   4.4 本章小结
• 第五章 B.megaterium BM2转录组分析及形态基因的表达量差异分析
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 菌株
•     5.1.2 生长培养基
•     5.1.3 仪器设备
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 生长曲线及生长过程中菌体形态观察
•     5.2.2 B.megaterium BM2转录组测序样品的准备
•     5.2.3 RNA的制备
•     5.2.4 转录组测序
•     5.2.5 差异基因分析
•     5.2.6 形态学相关基因差异性表达分析
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 RNA样品质量检测
•     5.3.2 不同时间点的样品组间差异表达基因分析
•     5.3.3 形态相关基因差异性分析
•     5.3.4 已敲除基因在表达水平的验证
•   5.4 本章小结
• 总结与展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨舟

导师: 门兴元,杨春玉

关键词: 巨大芽孢杆菌,基因组学,转录组,基因敲除,形态学,磷壁酸

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东大学

分类号: Q93

总页数: 124

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