轮状病毒VP7糖蛋白基因的克隆及在毕赤酵母菌中的表达及免疫原性的分析

论文摘要

轮状病毒（Rotavirus,RV）是一种双链核糖核酸病毒,属于呼肠孤病毒科,流行病学调查显示,轮状病毒是秋冬季引起婴幼儿感染性腹泻的重要致病因子,全世界每年有大约一亿人感染该病毒。目前,研制安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段之一。本研究通过基因克隆和重组技术检测20份患儿的粪便标本,提取病毒RNA,再逆转录为cDNA,根据GenBank中发表的VP7全序列设计引物,应用RT-PCR技术,从分离的轮状病毒中扩增出来960bp特异性目的片段,并构建融合表达载体pPICZαA-VP7,转入GS115毕赤酵母中。经1%甲醇诱导,镍柱亲和层析蛋白纯化,获得浓度为0.65mg/mL单一目的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot分析VP7蛋白的表达。结果显示克隆的VP7基因与预计的糖蛋白基因大小一致,构建的重组表达载体在GS115毕赤酵母中表达出分子质量约34kD重组糖蛋白,说明成功克隆和表达了轮状病毒的糖蛋白基因。经小鼠免疫实验结果表明,VP7蛋白加强免疫2周后,肌注组（IM）和滴鼻组（IN）小鼠IgG抗体几何平均滴度分别达到492和676,滴鼻组SIgA平均几何滴度达到43.5,可产生高水平的IFN-γ,表明VP7蛋白免疫可以有效地诱导机体产生细胞免疫,具有进一步开发研究的价值。

论文目录

• 材料与方法
•   1菌种与标本来源
•   2主要试剂
•   3培养基
•   4病毒总RNA的提取
•   5 RT-PCR扩增目的片段
•   6重组毕赤酵母表达载体的构建
•   7 VP7目的蛋白的表达
•   8重组抗原VP7免疫动物实验
•   9抗体水平检测
•   10ELISPOT检测分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴细胞数[20]
• 结果
•   1 VP7基因的克隆
•   2阳性重组克隆的筛选
•   3重组表达质粒PCR与酶切鉴定结果
•   4 VP7蛋白的纯化及鉴定
•   5 VP7融合蛋白的表达
•   6 VP7免疫小鼠血清IgG抗体水平
•   7 VP7免疫小鼠肠匀浆SIgA抗体水平及中和效价检测
•   8 ELISPOT计数分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴细胞
• 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王红涛,肖智

关键词: 轮状病毒,糖蛋白,毕赤酵母菌,动物免疫

来源: 病毒学报 2019年05期

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 通化师范学院生命科学学院

分类号: R373

DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003584

页码: 770-776

总页数: 7

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