阿魏酸对福氏志贺菌浮游生长及生物膜形成的影响及作用机制

论文摘要

福氏志贺菌（Shigella flexneri）是引起细菌性痢疾重要的病原菌,也是在发展中国家流行的优势菌群。近年来,抗生素的滥用导致越来越多的“超级细菌”出现,多重耐药性福氏志贺菌的进化与传播已成为全球范围内重要的公共卫生问题。浮游生长的福氏志贺菌能够在食品及其加工环境中的各种生物或非生物表面附着并形成生物膜。生物膜的形成极大地增加了细菌对清洁剂和抗生素的抗性及持续性细菌污染发生的概率。因此,寻求一种有效的控制方法迫在眉睫。阿魏酸具有天然、营养、安全等优点,并且来源广泛、生理功能多样、消费者接受程度高。基于此,本研究以提取于稻谷加工副产品中的阿魏酸处理福氏志贺菌,旨在探讨采用阿魏酸预防和控制福氏志贺菌浮游生长及生物膜形成的影响及可能的作用机制,以期为食品工业中福氏志贺菌及其生物膜的有效控制和开发基于阿魏酸的食品防腐保鲜剂奠定理论基础,并对谷物加工副产物资源的深度开发利用提供新的视野。主要研究结果如下:1、阿魏酸对福氏志贺菌浮游生长具有良好的抑制效果,具体表现为最大菌群密度和最大生长速率的降低。此外,阿魏酸可通过靶向福氏志贺菌细胞膜使其发生不可逆的损伤,从而引起细菌细胞活力下降、细胞膜通透性增加、细胞内容物外泄、蛋白质合成受阻、质子泵水解速率加快、细胞膜去极化,最终导致浮游生长的福氏志贺菌死亡;2、阿魏酸可显著抑制福氏志贺菌初始粘附的发生及生物膜的形成,并且具有靶向抑制生物膜内菌群结构和胞外聚合物形成的双重效果。这种抑制作用具体表现为阿魏酸不仅可以引起生物膜内菌群数量、代谢活力及ATP含量发生显著降低,而且可以减少构成生物膜胞外基质的三种主成分（胞外多糖、胞外蛋白和胞外DNA）的含量。此外,阿魏酸对聚苯乙烯塑材、玻璃及不锈钢三种常见食品包装材料表面福氏志贺菌形成的成熟生物膜具有有效的消减及清除作用;3、亚抑菌浓度阿魏酸干预生物膜态福氏志贺菌的转录组学测序及生物信息学分析共筛选识别出702个差异表达基因,其中169个差异基因上调表达,533个差异基因下调表达。KEGG通路富集分析表明,差异基因主要富集于核糖体循环、柠檬酸循环及ABC转运蛋白等代谢通路。此外,亚抑菌浓度阿魏酸抑制了与福氏志贺菌粘附及生物膜主成分合成与转运相关基因的表达。RT-qPCR验证结果表明,csgD、mdoC、yojN、rcsC、rcsB和waaG等与福氏志贺菌生物膜形成相关的目标基因表达趋势与转录组测序结果一致,进一步证明了转录组测序结果的可靠性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 福氏志贺菌概述
•     1.1.1 福氏志贺菌概况
•     1.1.2 福氏志贺菌在食品及其加工环境中的传播途径及生长特性
•     1.1.3 福氏志贺菌污染的预防及控制措施
•   1.2 细菌生物膜概述
•     1.2.1 细菌生物膜概况
•     1.2.2 细菌生物膜的形成
•     1.2.3 生物膜的危害及控制策略
•   1.3 阿魏酸概述
•     1.3.1 阿魏酸的来源及结构特性
•     1.3.2 阿魏酸的生物活性
•     1.3.3 阿魏酸在食品中的应用
•   1.4 研究意义与主要内容
•     1.4.1 研究意义
•     1.4.2 主要内容
•     1.4.3 技术路线
• 第二章 阿魏酸对福氏志贺菌浮游生长的抑制影响及其作用机制
•   2.1 材料与仪器
•     2.1.1 供试材料及菌株
•     2.1.2 主要试剂及耗材
•     2.1.3 主要试剂配制方法
•     2.1.4 主要仪器与设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 菌种保藏与活化
•     2.2.2 阿魏酸对福氏志贺菌抑菌活力的测定
•     2.2.3 生长曲线的测定
•     2.2.4 细菌活力的检测
•     2.2.5 细胞膜通透性的测定
•     2.2.6 胞外钾离子及蛋白质浓度的测定
•     2.2.7 胞内蛋白浓度的测定及SDS-PAGE电泳检测
•     2.2.8 细胞膜电位的检测
•     2.2.9 细菌胞内外ATP浓度及ATP酶活力的测定
•     2.2.10 场发射扫描电镜及透射电镜分析
•     2.2.11 数据处理
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 阿魏酸对福氏志贺菌抑菌活性的评价
•     2.3.2 阿魏酸对福氏志贺菌浮游生长的影响
•     2.3.3 阿魏酸对福氏志贺菌细胞活力的影响
•     2.3.4 阿魏酸对福氏志贺菌细胞膜通透性的影响
•     2.3.5 阿魏酸对福氏志贺菌胞内钾离子和蛋白质泄漏的影响
•     2.3.6 阿魏酸对福氏志贺菌胞内蛋白的影响
•     2.3.7 阿魏酸对福氏志贺菌胞内外ATP含量及ATP酶活力的影响
•     2.3.8 阿魏酸对福氏志贺菌细胞膜电位的影响
•     2.3.9 阿魏酸对福氏志贺菌表面形态及内部结构的影响
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 第三章 阿魏酸对福氏志贺菌生物膜的抑制及消减作用
•   3.1 材料与仪器
•     3.1.1 供试材料及菌株
•     3.1.2 主要试剂及耗材
•     3.1.3 主要试剂配制方法
•     3.1.4 实验仪器与设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 菌种保藏与活化
•     3.2.2 阿魏酸抗生物膜活性的测定
•     3.2.3 福氏志贺菌初始粘附率的测定
•     3.2.4 福氏志贺菌生物膜形成的结晶紫半定量测定
•     3.2.5 福氏志贺菌生物膜中菌群代谢活性及ATP浓度的测定
•     3.2.6 生物膜形态的环境扫描电镜分析
•     3.2.7 生物膜中活菌数量测定及激光共聚焦扫描显微镜分析
•     3.2.8 福氏志贺菌生物膜中多糖、蛋白和DNA含量的测定
•       3.2.8.1 生物膜中胞外多糖含量的测定及观察
•       3.2.8.2 生物膜中胞外蛋白的测定及观察
•       3.2.8.3 生物膜中eDNA的测定
•     3.2.9 阿魏酸对成熟生物膜的消减作用分析
•     3.2.10 数据处理
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 阿魏酸对福氏志贺菌的抗菌膜活性评价
•     3.3.2 阿魏酸对福氏志贺菌初始粘附的影响
•     3.3.3 阿魏酸对福氏志贺菌生物膜形成的影响
•     3.3.4 阿魏酸对福氏志贺菌生物膜中菌群代谢活性及ATP浓度的影响
•     3.3.5 阿魏酸对福氏志贺菌生物膜中活菌数量的影响
•     3.3.6 阿魏酸对福氏志贺菌生物膜主成分的影响
•     3.3.7 阿魏酸对玻璃和不锈钢材料表面成熟生物膜的影响
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 第四章 阿魏酸干预福氏志贺菌生物膜形成的分子机制
•   4.1 材料与仪器
•     4.1.1 供试材料及菌株
•     4.1.2 主要化学品及试剂
•     4.1.3 实验仪器与设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 生物膜的培养及RNA的提取与检测
•     4.2.2 文库的构建及RNA测序
•     4.2.3 数据质控及参考序列比对分析
•     4.2.4 转录组测序所得基因表达量统计及差异表达分析
•     4.2.5 差异基因功能注释及富集分析
•     4.2.6 实时荧光定量PCR测定
•     4.2.7 差异基因编码的蛋白质互作分析
•   4.3 结果分析
•     4.3.1 总RNA质量检测结果
•     4.3.2 测序数据质量评估
•     4.3.3 参考序列比对结果评价
•     4.3.4 样本间差异性评估
•     4.3.5 差异表达基因的模式聚类分析
•     4.3.6 差异表达基因的可视化分析
•     4.3.7 差异表达基因的GO富集分析
•     4.3.8 差异表达基因的KEGG富集分析
•     4.3.9 差异基因的COG功能富集分析
•     4.3.10 生物膜形成相关差异基因表达情况及实时荧光定量PCR分析
•     4.3.11 差异基因编码的蛋白互作网络
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 康佳木

导师: 刘柳

关键词: 阿魏酸,福氏志贺菌,生物膜,转录组测序

来源: 陕西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 陕西师范大学

分类号: TS201.3;TS202.3

DOI: 10.27292/d.cnki.gsxfu.2019.001331

总页数: 97

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