一、ARF蛋白——p53蛋白的重要调控因子（论文文献综述）
苏明俊[1]（2021）在《PEDVN蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制》文中提出猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起猪的一种急性、高度接触性肠道传染病,给我国养猪业带来严重危害。尽管PEDV疫苗在我国广泛应用,PED仍然频繁发生。因此,PEDV防控相关的基础研究十分必要。病毒与宿主长期相互作用过程中,能通过介导宿主细胞周期阻滞创造有利于病毒复制的细胞微环境。由此可见,阐明病毒调控细胞周期阻滞的机制,能为抗病毒设计提供理论基础。目前,PEDV等冠状病毒的N蛋白能诱导细胞周期阻滞,但其机制尚未明晰。本研究对PEDV N蛋白介导细胞周期阻滞的机制进行了研究,进一步探索了基于该机制的抗病毒药物。研究内容包括以下四个方面:1.PEDV N蛋白介导Vero E6细胞S期阻滞的确证以及对病毒复制的影响为明确PEDV N蛋白对细胞周期的调控作用,将N蛋白在非同步化Vero E6细胞和血清饥饿法介导的G0/G1期、胸苷介导的S期、诺考达唑介导的G2/M期同步化的Vero E6细胞中分别过表达,对细胞周期和病毒滴度进行检测与分析。结果显示,在非同步化细胞中,不同浓度N蛋白组的S期细胞占比分别为22.91%（1.0μg/m L）、29.66%（2.5μg/m L）和36.38%（4.5μg/m L）,均显着高于对照组（21.68%）,N蛋白浓度与S期细胞数量正相关;在N蛋白（4.5μg/m L）过表达的G0/G1期、S期、G2/M期同步化细胞中,S期细胞占比分别为32.07%、58.50%和25.50%,均显着高于对照组（14.08%、49.56%和8.30%）（P<0.01）。在非同步化细胞中,PEDV滴度（48 hpi）为5.45 log10 TCID50/m L,显着高于对照组(4.67 log10 TCID50/m L)（P<0.01）;在同步化细胞中,PEDV滴度（48 hpi）为5.54 log10 TCID50/m L,显着高于对照组(4.77 log10 TCID50/m L)（P<0.01）。上述结果证明,PEDV N蛋白能介导Vero E6细胞发生S期阻滞,S期阻滞增强PEDV复制。2.PEDV N蛋白介导Vero E6细胞S期阻滞分子机制研究为揭示PEDV N蛋白诱导细胞S期阻滞的机制,本研究利用活细胞成像系统、免疫共沉淀（Co-IP）和N蛋白截短突变体构建等方法,探索了p53-DREAM信号通路在PEDV N蛋白介导细胞S期阻滞中潜在的作用。结果显示,在N蛋白过表达的Vero E6细胞中p53表达水平显着升高（P<0.01）;利用p53抑制剂PFT-α处理细胞后,在N蛋白过表达的Vero E6细胞中S期细胞占比和PEDV滴度均显着下降（P<0.05）。PEDV N蛋白能显着上调p21表达、抑制p130磷酸化、下调E2F4和cyclin A表达（P<0.01）;同时,PFT-α能拮抗N蛋白对p21、p130、E2F4和cyclin A的调控作用（P<0.05）。这些数据证明,PEDV N蛋白通过激活p53-DREAM信号通路介导Vero E6细胞发生S期阻滞。进一步研究显示,N蛋白与p53在Vero E6细胞核中存在共定位,维持p53在细胞核中高水平表达;N蛋白介导细胞S期阻滞依赖于N蛋白与p53核共定位以及N蛋白的核定位信号S71NWHFYYLGTGPHADLRYRT90。进一步证实,N蛋白与p53存在直接相互作用,关键氨基酸区域是S171RGNSQNRGNNQGRGASQNRGGNN194(NS171-N194),其中,G183RG185为核心氨基酸位点。N蛋白突变体Nmut(R183RR185)与p53相互作用显着减弱,介导细胞周期S期阻滞显着下降（32.79%）（P<0.01）;在Nmut过表达的Vero E6细胞中,PEDV滴度(5.38 log10 TCID50/m L)显着低于对照组(5.67 log10 TCID50/m L)（P<0.05）。上述结果证明,PEDV N蛋白入核后通过NS171-N194区域与p53直接相互作用,维持p53高水平表达,进而激活p53-DREAM信号通路,介导Vero E6细胞发生S期阻滞。3.基于PEDV N蛋白介导S期阻滞机制的抗病毒药物设计为获得能干预PEDV N蛋白介导细胞周期S期阻滞的小分子药物,本研究利用分子对接技术筛选能靶向结合N蛋白S171-N194区域的小分子化合物,进一步评价筛选的小分子化合物抗病毒作用。分子对接分析显示,金丝桃苷（Hyperoside）与PEDV N蛋白具有较强的结合力,“-CDOCKER ENERGY”和“-CDOCKER INTERACTION ENERGY”值分别为24.47和49.57。生物膜干涉技术（BLI）分析显示,金丝桃苷与N蛋白具有特异性结合作用,呈现浓度依赖性。金丝桃苷能拮抗N蛋白与p53相互作用（P<0.05）,干预N蛋白介导Vero E6细胞S期阻滞（P<0.05）。金丝桃苷处理组中PEDV滴度为5.13 log10TCID50/m L,显着低于对照组(5.63 log10 TCID50/m L)（P<0.05）。上述结果表明,基于N蛋白调控细胞周期机制设计的小分子药物金丝桃苷,能够拮抗PEDV N蛋白与p53相互作用,干预N蛋白介导细胞周期S期阻滞,进而抑制PEDV复制。4.PEDV N蛋白介导S期阻滞分子机制在仔猪肠道细胞IPEC-J2上验证由于Vero E6细胞是PEDV非本宿主的易感细胞,本研究进一步在猪肠道细胞IPEC-J2中对PEDV N蛋白介导的细胞周期阻滞机制进行了验证。结果显示,在过表达N蛋白的IPEC-J2细胞中,S期细胞占比（40.94%）显着高于对照组（37.57%）（P<0.01）,PEDV复制显着增强（P<0.05）。进一步研究证实,PEDV N蛋白与猪源p53存在直接相互作用;在表达Nmut的IPEC-J2细胞中,S期细胞占比（37.57%）显着低于对照组（40.94%）（P<0.05）;金丝桃苷显着降低IPEC-J2 S期细胞占比（P<0.05）,抑制PEDV复制（P<0.05）。上述结果表明,PEDV N蛋白介导IPEC-J2细胞周期S期阻滞的分子机制与Vero E6细胞一致。综上所述,PEDV N蛋白进入细胞核后,通过自身NS171-N194区域与p53相互作用,激活p53-DREAM信号通路,从而诱导宿主细胞S期阻滞,为PEDV复制创造了有利的细胞微环境。基于PEDV N蛋白介导的细胞周期阻滞机制设计的小分子药物金丝桃苷,能通过靶向拮抗N蛋白与p53相互作用,干预N蛋白介导细胞周期S期阻滞,进而抑制PEDV复制。本研究揭示了PEDV N蛋白调控宿主细胞周期的一个新机制,为PEDV等冠状病毒的抗病毒策略提供了新思路。
陶冶[2]（2021）在《LncRNA MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴调控依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老》文中研究表明目的:细胞衰老是一种复杂的应激反应,是导致细胞生长停滞的一种不可逆状态,主要发生在细胞受到不同压力时,可以由多种不同因素（如复制应激、DNA损伤、氧化应激、癌基因诱导、化学疗法、线粒体功能障碍、表观遗传和旁分泌）所触发。恶性肿瘤是一种年龄相关疾病,是老年人主要的死亡原因之一。细胞衰老可以发生在不同的生理和病理过程中,在癌症治疗中,诱导细胞衰老是肿瘤发生发展的有效屏障,是重要的抑癌机制之一。随着抑癌机制研究的不断深入,通过诱导肿瘤细胞衰老来阻止肿瘤发展正逐渐受到重视,诱导肿瘤细胞衰老的具体生物学过程也越来越受到关注。长链非编码RNA（lncRNAs）通过在转录、转录后和表观遗传水平调控基因表达,在广泛的生物学过程中发挥着核心调节因子的作用。对lncRNAs重叠蛋白编码基因启动子区域的研究发现,许多lncRNAs都与细胞周期调控相关,这暗示了lncRNAs在不同生物学过程中以及在细胞命运最终决定过程中的潜在作用。近年来,十余种lncRNAs被发现与细胞衰老相关。有研究表明,lnc MEG3可以通过影响内皮细胞功能进而在调控血管内皮细胞衰老方面发挥重要的作用,所以深入探讨lnc MEG3在肿瘤细胞衰老过程中的作用机制,可能有助于揭示肿瘤细胞衰老与抑癌机制相互联系的分子基础,为诱导肿瘤细胞过程中lnc MEG3成为肿瘤治疗的新方向奠定基础。本课题组前期实验已经证实,在肿瘤细胞衰老过程中YAP出核增加,其表达受到抑制会导致细胞增殖能力下降。VGLL4是包含TDU结构域的VGLL家族转录辅因子（VGLL1-4）的成员,在多种肿瘤细胞中起到强大的抑癌作用,目前已有文献报道了在细胞增殖过程中,VGLL4作为一个共转录因子可以与YAP竞争性结合下游的转录因子。Lnc RNAs可以通过与miRNAs,m RNAs和蛋白质的相互作用在基因表达的表观遗传调控中起关键作用,而miRNAs也可以直接或间接地影响lncRNAs的表达水平。许多文献已经报道了lncRNAs通过发挥分子海绵的作用影响下游miRNAs的表达水平。越来越多的证据表明,lncRNA/micro RNA/m RNA调控轴参与了多种细胞生物学过程。鉴于诱导肿瘤细胞衰老的转录及转录后调控在基因表达中的重要作用,本实验旨在前期工作基础上明确lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴在依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老过程中的生物学作用,并进一步探索诱导肿瘤细胞衰老对于癌症治疗的重要意义。研究方法:1、体外培养肺腺癌A549细胞系及乳腺癌MCF-7细胞系,利用依托泊苷诱导并构建上述两种肿瘤细胞的衰老模型;2、利用SA-β-Gal染色验证上述建立的A549及MCF-7细胞模型的衰老程度;3、利用Western Blot检测细胞衰老过程中,衰老相关基因的表达变化,利用qRT-PCR检测衰老相关基因及衰老相关分泌表型基因的m RNA表达变化;4、利用流式细胞仪检测并验证依托泊苷诱导的A549及MCF-7细胞衰老模型的细胞周期阻滞情况;5、利用生物信息学分析并筛选依托泊苷诱导A549细胞衰老过程中的差异基因;6、利用qRT-PCR检测lnc MEG3的表达水平并检测lnc MEG3高或低表达对肿瘤细胞衰老程度及衰老相关基因表达水平的影响;7、利用免疫荧光法检测衰老过程中VGLL4的核定位情况;分离并提取细胞核、浆蛋白,利用Western Blot检测VGLL4在细胞胞浆及胞核中的表达情况;8、利用生物信息学方法预测lnc MEG3及VGLL4的靶micro RNA,利用双荧光素酶报告检测目的基因与靶micro RNA的结合情况;9、利用qRT-PCR及Western Blot检测miR-16-5p的表达水平并检测miR-16-5p高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因表达水平的影响;10、利用qRT-PCR检测VGLL4的表达水平并检测VGLL4高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因m RNA表达水平的影响;11、利用Western Blot检测VGLL4的表达水平并检测VGLL4高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因蛋白表达水平的影响;12、利用SA-β-Gal染色及Western Blot检测lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4调控轴的功能:对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因蛋白表达水平的影响。结果:1、低剂量依托泊苷可以诱导A549及MCF-7细胞衰老;2、LncMEG3在A549及MCF-7细胞衰老模型中表达升高;3、低表达lnc MEG3显着抑制A549及MCF-7细胞衰老,高表达lnc MEG3在一定程度上促进A549及MCF-7细胞衰老;4、在A549及MCF-7细胞衰老模型中,共转录因子VGLL4与YAP形成竞争性抑制,VGLL4在细胞核内表达增加,在细胞内总表达水平上调;5、在A549及MCF-7细胞衰老模型中,lnc MEG3通过直接相互作用抑制miR-16-5p的表达;6、Mi R-16-5p参与了A549及MCF-7细胞的衰老过程;7、VGLL4在A549及MCF-7细胞衰老过程中是miR-16-5p的直接靶基因;8、VGLL4参与了A549及MCF-7细胞衰老过程的调控;9、在A549及MCF-7细胞衰老过程中VGLL4的表达受lnc MEG3的调控;10、在A549及MCF-7细胞衰老过程中,lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴发挥了调控作用。结论:1、在肿瘤细胞衰老过程中,lnc MEG3通过海绵效应与miR-16-5p结合并抑制miR-16-5p表达,进而解除miR-16-5p对VGLL4表达的抑制作用,最终影响肿瘤细胞衰老过程;2、肿瘤细胞衰老过程中VGLL4表达水平上调且受lnc MEG3的调控;3、肿瘤细胞衰老过程中存在VGLL4的细胞内异位。
白玲[3]（2021）在《CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究》文中研究说明背景:急性B淋巴细胞白血病（B-cell Acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）的免疫治疗发展迅速,使复发难治B-ALL的有效率从30%提高到90%;但由于其副作用和疗效仍然有限而限制了其应用。因此,寻找减少毒副作用和延长生存期的新策略至关重要。TLR9激动剂作为一种免疫佐剂在抗肿瘤治疗中已显示出良好的安全性和有效性,其不仅具有免疫调节作用,对于肿瘤细胞也具有直接作用。它能够在增强抗肿瘤免疫的同时影响肿瘤的抑制性免疫微环境,从而促进免疫系统更好地识别肿瘤,实现“冷肿瘤”向“热肿瘤”的转变。然而,既往的研究主要集中在其免疫调节方面,而对于肿瘤的直接作用常被忽略,尤其是对于B-ALL的直接作用尚无报道。通过我们前期研究发现:TLR9激动剂能够抑制B-ALL增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞而清除B-ALL,但对于不同类型B-ALL的作用具有异质性。因此,明确TLR9激动剂在不同类型B-ALL患者中的作用及分子机制,可能有助于发掘TLR9激动剂治疗有效的生物标志物和患者特征,优化B-ALL的精准治疗。研究目的:1.明确TLR9表达与B-ALL患者临床病理特征及预后的关系;2.探索CpG 685对B-ALL的作用;3.探讨CpG 685诱导B-ALL细胞凋亡的分子机制,发掘治疗有效的关键生物标志物;4.寻找针对不同类型B-ALL的治疗策略以及CpG 685应用有效的预测标志物。研究方法：1.通过实时定量RT-PCR和流式细胞术检测TLR9的表达,应用统计学分析明确TLR9表达与临床病理特征及预后的关系;2.通过WST-1增殖实验、AnnexinⅤ/7-AAD凋亡检测和流式细胞术检测CpG 685在不同类型B-ALL中的作用,明确CpG 685对B-ALL细胞体外直接作用的差异;3.通过构建NCG B-ALL小鼠移植瘤模型,应用流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏和外周血中肿瘤负荷的变化和观察小鼠生存期,明确CpG 685对B-ALL细胞在体内的作用差异;4.通过有或无相关信号通路及关键分子抑制剂预处理,在CpG 685刺激后,应用Western Blot、蛋白纯化及免疫沉淀、免疫荧光共定位、染色质免疫共沉淀检测TLR9下游信号通路相关蛋白的表达和基因的作用位点;通过RT-PCR和实时定量RT-PCR明确通路涉及的mi RNA的表达情况;通过对其作用机制的探究,发掘CpG 685治疗B-ALL有效的预测生物标志物;5.通过Ficol密度梯度离心法分离临床样本中的外周血单个核细胞,在有或无CpG 685刺激后,明确基于细胞系发现的预测标志物在临床应用中的可行性;6.通过在BALB/C小鼠中构建肿瘤移植瘤模型,应用流式细胞术检测各种免疫细胞所占小鼠淋巴细胞的比例,明确CpG ODN对小鼠机体抗肿瘤免疫的调节情况。研究结果:1.相比于正常人的外周血单个核细胞,TLR9在B-ALL患者的外周血单个核细胞中高表达;并且,相比于TLR9低表达组,高表达组的B-ALL患者预后较好;2.CpG 685对B-ALL细胞的作用存在异质性。对于BLIN-1细胞,其能抑制增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞、上调共刺激分子及免疫调节分子、降低小鼠骨髓、脾脏和外周的肿瘤负荷、延长生存期;而对于Sup-B15细胞无明显作用;3.BLIN-1细胞中,CpG 685通过P38/P53/BAX信号通路,依赖C-MYC过表达诱导B-ALL细胞凋亡。过表达的C-MYC可以促进P53稳定,诱导P53磷酸化,增强BAX转录,并介导BAX激活相关构象改变。4.伊马替尼和CpG 685联合应用于Ph（+）B-ALL细胞逆转两药单独应用的耐药、降低小鼠肿瘤负荷、延长小鼠生存期;伊马替尼能促进BAX的激活,同时抑制C-MYC低表达的抗凋亡效应;而CpG 685通过下调mi R-21,上调PTEN,进而逆转了PI3K/AKT/m TOR通路过度激活所致的伊马替尼耐药;5.临床患者中,CpG 685可直接诱导PBMC C-MYC高表达且Ph染色体阴性的B-ALL患者的原代B-ALL细胞凋亡;6.CpG ODN能够促进B细胞、pDC细胞的增殖,抑制MDSC细胞增殖,进而增加NK细胞、T细胞的比例,促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,促进抗肿瘤免疫的激活。结论:1.TLR9的表达与B-ALL患者的预后相关;2.TLR9是B-ALL潜在的治疗靶点,CpG 685可通过P38/P53/BAX信号通路诱导B-ALL细胞凋亡,该过程依赖于C-MYC的高表达;3.C-MYC可能是协助预测CpG 685单药对B-ALL患者有效的预测标志物;4.而对于Ph（+）B-ALL,联合应用伊马替尼和CpG 685可逆转两药单独应用的耐药。该联合治疗不仅能直接诱导Ph（+）B-ALL细胞凋亡,还增强了B-ALL细胞的免疫原性,促进CD8+T细胞的识别。5.CpG ODN能够通过促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,激活抗肿瘤免疫。
赵浩[4]（2021）在《CDC6调节脑胶质瘤细胞增殖和侵袭及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:胶质瘤（Glioma）是神经外科临床诊疗工作中常见的原发性颅脑肿瘤,主要的肿瘤类型包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和室管膜瘤,在组织学上分类为低级别肿瘤以及高级别肿瘤。世界卫生组织（WHO）根据特定的病理特征对胶质瘤进行分级,其中包括核不典型性、有丝分裂活性、血管增生、坏死、增殖潜能、临床病程和治疗结果。多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）是最常见的Ⅳ级胶质瘤和原发性恶性脑肿瘤,发病率为每10万人年3-8例,平均诊断年龄为64岁;原发性GBM占所有非继发性的中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）恶性肿瘤的80%左右。相比来说,男性的发病率是女性的1.5倍左右,白人的发病率约为黑人的3倍。对于新诊断的GBM患者,目前即使进行标准治疗方案,包括最大限度安全切除,放射治疗,联合替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）然后维持化疗,患者的中位生存期仅有12-18个月。同时,影响预后的因素包括诊断时的Karnofsky功能状态量表、组织学以及分子标记物。其中,Karnofsky功能状态评分与病患的预后正相关,而WHO肿瘤分级与预后呈负相关。将异柠檬酸脱氢酶（IDH）1/2的突变与1p/19q编码是否缺失结合应用之后,2016年世界卫生组织（WHO）对中枢神经系统肿瘤的分类更加精细化,所谓的低级别和高级别肿瘤的概念也有了与以往不同的内涵。然而,相同级别和分类的肿瘤在得到了程序化的综合治理后,患者的临床结局和副反应却不尽相同。这提示我们仍需要在胶质瘤的研究中探索更有指导意义的作用位点。本次研究中,我们讨论了细胞分裂周期蛋白6（Cell Division Cycle protein 6,CDC6）在胶质瘤中的功能和致癌特性。CDC6主要在细胞的DNA复制过程发挥作用,是细胞复制起始不可或缺的关键蛋白。人类CDC6基因被定位于染色体17q21.3。主要负责编码一个AAA+ATPase,该AAA+ATPase与复制起点识别复合物（Origin Recognition Complex,ORC）结合,并有助于募集微染色体维持（Minichromosome Maintenance Protein,MCM）复合物。在形成这种复合物并随后与调节因子和复制叉成分结合后,双链DNA复制过程得以启动。CDC6蛋白缺失的细胞无法进行DNA合成,通过RNA干扰抑制CDC6的表达后,可使细胞的增殖受到明显的抑制,并且诱导细胞进入凋亡程序。CDC6-siRNA转染的细胞S期CDC6表达明显下调,导致DNA复制效率低下,并阻止了新起点的激活。目前认为,CDC6能够通过激活共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白激酶（Ataxia Telangiectasia and Rad3-related Protein Kinase,ATR）继而触发了检查点激酶1（Checkpoint kinase 1,CHK1）,后者涉及到人类细胞分裂周期的S-M检查点机制,以维持DNA复制进程正常规律的进行。因而,CDC6能够稳定和介导细胞的检查点反应的激活过程,从而也保证在DNA正常复制结束前阻止有丝分裂的进行。反之,CDC6的缺失不能激活CHK1激酶,并影响到有丝分裂,导致异常的染色体分离和细胞复制的效率下降。近年来的研究中发现,CDC6还具有转录调节因子和染色质重塑等作用。其中,CDC6蛋白的稳定被认为与活化的MAPK以及AKT信号通路有关。AKT信号通路的活化在诸多肿瘤的研究中观察到。既往的许多实验中都已经观察到,对比正常胶质细胞时,胶质母细胞瘤细胞中PI3K和AKT基因有明显的扩增;AKT信号通路被认为是许多细胞过程的关键通路,在各类上游调控因子的参与下,涉及了包括肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭在内的大多数细胞进程。其中包括了下游的基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）家族蛋白的表达。MMP-2和MMP-9主要参与了细胞间基质的Ⅳ型胶原的降解,因而被认为是调控肿瘤细胞侵袭能力和转移能力的关键酶。所以,MMPs的表达的改变能够影响胶质瘤干细胞以及胶质瘤细胞的侵袭能力。因而,对CDC6的探讨同样是研究AKT-MMP通路的上游调节因子的重要方向之一。鉴于CDC6在多种肿瘤中的异常表达及重要作用,近年来针对其上游转录调控因子的甄别已有相关研究报道。文献显示,CDC6受到许多对人类癌症发展至关重要的基因座的表达的影响;其中,叉头盒蛋白P1（Forkhead Box Protein P1,FOXP1）和雄激素受体（Androgen Receptor,AR）均是可能影响CDC6表达的上游转录调节因子。FOX家族成员是一组特定的DNA结合蛋白,其特征性标志是都具有相对保守的FOX结构域。FOXP1是FOX家族的成员之一,能够干扰转录调控和DNA修复过程,参与了调节多种人类癌症的肿瘤发生,并且参与了免疫应答反应、器官发育过程和癌症发病以及进展等诸多过程。在对前列腺癌的研究中发现,在CDC6启动子5’-TGTTTGTT-3’中存在一个潜在的FOX顺式调控结合基序。FOXP1的沉默能够明显降低胶质瘤细胞的增殖效率;而FOXP1的表达的升高往往与胶质母细胞瘤病患的较低生存率显着相关。同样,CDC6在上游启动子区域内雄激素受体（AR）结合了相应的位点之后有序表达,参与了调控DNA复制和检查点机制。CDC6的转录可以受雄激素受体（AR）或E2F单独或双重联合调控。在前列腺癌细胞（PCa）中,CDC6基因的表达是以雄激素受体依赖的方式调节的,转录激活是由AR和CDC6启动子中的特定顺式调控区相结合介导的。此外,AR作为复制前复合物的一个组成部分,通过与CDC6的蛋白质相互作用,驱动前列腺癌细胞从G1期进展到S期。总而言之,胶质瘤的发生、进展和恶化是肿瘤细胞生成、增殖、迁移、侵袭等生物学行为改变的结果,也是造成不同级别胶质瘤的差异的原因,继而导致病人的临床表现以及实际选择的诊疗方案和患者的临床结局迥然不同。而CDC6既是细胞复制周期过程中的关键因子,同样也参与了细胞的转录调节过程的控制;已知CDC6的过表达促进了细胞恶性变,对肿瘤细胞的增殖和侵袭等生物学行为的增强有着不可忽视的影响;而CDC6的表达抑制则出现了相反的结果。遗憾的是,CDC6分子在胶质瘤细胞中的影响和临床意义以及其具体调控机制仍存有很多未知。目的:本研究旨在探讨CDC6表达与脑胶质瘤形成、发展及病人预后的关系;并对CDC6参与胶质瘤细胞的增殖、侵袭等恶性进展的作用机制做深入的探讨;同时对影响CDC6表达的可能的上游转录调节因子进行相应的研究。方法:1.利用肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）提供的167例多形性胶质母细胞瘤（GBM）样本和相应的202例癌旁组织基因型表达的mRNA 数据集（GTEx,https://commonfund.nih.gov/GTEx/）并进行比较分析,探讨CDC6在胶质瘤中的表达变化,并探究CDC6在胶质瘤中的生成、发展中的价值,以及与死亡天数（也称为总生存率（Overall survival,OS））、初次治疗后新发的天数（Days to Neoplasm,D2N）、初始治疗后的症状再进展天数（Days to Progression,D2P）和初次治疗后的肿瘤复发天数（Days to Recurrence,D2R）等预后指标的相关性,然后采用Cox多因素回归分析,探讨CDC6表达、年龄、性别、CpG岛甲基化表型（CIMP）及复发情况等多因素对胶质瘤患者预后的影响。2.选用星形细胞HA1800和胶质瘤细胞系U118和U87作为体外细胞模型,应用RT-PCR、Western blot等实验方法来进行检测以验证数据库的研究结论;再通过转染CDC6-siRNA,构建表达CDC6降低的U118和U87细胞株。利用CCK8实验体系检测CDC6敲低后U118和U87细胞增殖力的变化。使用Transwell实验体系探究CDC6表达下调U1 18和U87细胞侵袭力的变化。然后,通过Western blot检测深入探究CDC6在U118和U87细胞中发生、发展中所涉及的信号途径。3.通过 Jaspar（http://jaspar.genereg.net/）网站预测了 FOXP1 和 AR 在 CDC6 启动子区域或许存在各自的结合位点,利用Western blot实验结果检测FOXP1和AR在U118和U87细胞中的表达水平;在给予针对性的FOXP1-siRNA和AR-siRNA进行干扰之后,构建表达FOXP1和AR分别降低的U1 18和U87细胞模型。CCK8实验体系和Transwell实验体系观察U118和U87细胞模型的增殖和侵袭力的变化,然后,再通过Western blot实验检测U118和U87细胞模型中CDC6表达情况。结果:1.CDC6在胶质瘤中的表达及临床意义:分析数据库后发现,与正常脑组织相比,GBM肿瘤组织中CDC6水平明显升高;继而使用RT-PCR和Western blot方法证实了 GBM肿瘤组织对比正常人脑星形胶质细胞系中CDC6的表达存在显着差异。Kaplan-Meier分析表明CDC6高表达对GBM总生存率（OS）和症状再进展天数（D2P）有负面影响,但对初次治疗后的肿瘤复发天数（D2R）没有影响。Cox多元回归分析显示CDC6是GBM预后的独立标志基因,而且CDC6的mRNA表达与CpG岛甲基化表型（CIMP）联合检测能够较为敏感的预测治疗后3年的OS和D2P。2.CDC6在胶质瘤中的功能学实验:CCK8实体系的验结果表明,CDC6敲低后U118和U87细胞的增殖显着下降（P<0.001）;Transwell细胞实验体系证实了CDC6敲低的U118和U87细胞对比对照组,其侵袭明显受抑制（P<0.001）。接下来的Western Blot实验结果表明,CDC6敲低后可以通过抑制AKT的磷酸化来减少侵袭蛋白MMP-2、MMP-9的表达,从而降低U118和U87细胞的侵袭力;CDC6敲低后通过抑制ATR-CHK1通路中的ATR和CHK1蛋白的磷酸化来降低GBM细胞的增殖能力。3.CDC6的上游调控机制:Western blot实验结果证实了 FOXP1和AR的蛋白表达水平,与CDC6相似,在U118和U87细胞中明显高于正常胶质细胞;在给予针对性的FOXP1-siRNA和AR-siRNA进行干扰之后,FOXP1和AR的表达量明显下降,伴随出现了 U118和U87细胞的增殖和侵袭行为均受到了显着的抑制;同时实验组GBM细胞的CDC6表达也显着的低于正常对照组。因而,我们推测AR和FOXP1可能是通过调控CDC6来影响胶质瘤细胞的增殖和侵袭行为。结论及意义:1.CDC6在胶质瘤增殖和侵袭过程中有促进作用,并且与患者的预后负相关;2.CDC6通过调控ATR-CHK1途径和AKT-MMP途径干扰胶质瘤细胞的增殖和侵袭;3.AR和FOXP1可能是影响CDC6的上游转录调节因子。本研究首次揭示了 CDC6在胶质瘤进展和预后中参与的作用以及可能的相关机理和影响因素,为胶质瘤的诊断和治疗提供了新的思路。
孙耀华[5]（2021）在《结直肠癌中ARF6表达的临床意义及其通路分子的研究》文中研究指明研究背景:结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤,是威胁人民健康的杀手。尽管随着手术、放化疗及分子靶向治疗等技术的日益完善,CRC患者的生存期得到有效的延长,但整体来看,长期疗效并不理想,5年生存率仍仅为50%。因此,对其恶性进展机制的研究一直是肿瘤研究领域的热点。二磷酸腺苷核糖基化因子6（ADP ribosylation factor 6,ARF6）是Ras相关的G蛋白家族的一种小GTP酶结合蛋白。近年来已有多项研究发现,ARF6可通过介导多条通路调控肿瘤细胞的增殖,与多种恶性肿瘤的侵袭、转移有密切联系。但目前有关ARF6在CRC中的研究尚未见报道。为明确ARF6在CRC恶性进展中的作用,本课题分为三部分,分别探索ARF6在CRC中的表达及临床意义,初步探索CRC中ARF6上游调控因子,在以上研究的基础上进一步通过在线数据库分析ARF6通路分子在CRC中预后意义。第一部分ARF6在结直肠癌中的表达及其临床意义研究1、研究目的:明确ARF6在CRC组织中的表达,及其与CRC的临床病理特征及预后的关系。2、研究方法:收集长海医院资料完整、临床病理诊断明确的CRC共136例。所有病例均由石蜡包埋组织。采用苏木素-伊红染色观察CRC病理形态学特征及侵袭转移情况;根据标准确定组织学分级、TNM分期、肿瘤出芽程度。采用免疫组织化学检测ARF6、Ki-67蛋白表达。采用电话随访的方式采集患者术后及治疗情况。3、研究结果:ARF6在CRC肿瘤组织中的表达情况:ARF6选择性高表达在CRC癌组织,主要表达在细胞浆与细胞膜,阳性表现为黄色至棕褐色颗粒。ARF6在CRC癌组织中的表达水平与肿瘤淋巴结转移、TNM分期等密切相关（P<0.05）,而与患者的年龄、性别、肿瘤部位、Ki67增殖指数、同时伴发腺瘤、家族史、肿瘤大小、肿瘤大体类型、肿瘤分化、肿瘤粘液成分、浸润深度、伴有远处转移、肿瘤出芽、癌结节无明显相关（P>0.05）。ARF6高表达病例的生存曲线与低表达组未发现有明显差异,Log-Rank检验显示两组之间无统计学意义（χ2=2.608,P=0.106）。4、研究结论:ARF6在CRC癌组织中的高表达与淋巴结转移情况、TNM分期有显着相关性。第二部分结直肠癌中ARF6上游调控因子的研究1、研究目的:探索CRC中促进ARF6蛋白表达的可能机制。2、研究方法:采用免疫组织化学方法检测突变型P53蛋白在136例CRC组织中的表达情况,并采用荧光定量PCR检测K-ras、N-ras、BRAF基因突变。分析K-ras、N-ras、BRAF基因突变病例及野生型CRC病例之间ARF6蛋白表达差异。采用EPD真核启动子数据库预测ARF6启动子区结合的转录因子、结合位点及结合元件（Motif）。CRC细胞株感染携带KLF4的腺病毒,采用western blot检测KLF4对ARF6表达的调控作用。3、研究结果:（1）136例CRC患者的肿瘤组织中,P53野生型表达者20例（14.71%）、错义突变型表达者59例（43.38%）、无义突变型表达57例（41.91%）。ARF6蛋白表达水平与癌基因P53基因突变之间无统计学意义（χ2=0.258,P=0.611）。（2）136例CRC肿瘤组织中,检出RAS基因突变50例（36.76%）,其中KRAS基因突变47例,NRAS基因突变3例。ARF6蛋白表达水平与Ras基因突变状态之间无统计学意义（χ2=0.563,P=0.453）。（3）136例CRC肿瘤组织中,检出BRAF基因突变7例（5.15%）。ARF6蛋白表达水平与BRAF基因突变状态之间无统计学意义（χ2=0.007,P=0.653）。（4）生物信息学分析表明ARF6启动子区存在3个KLF4结合位点,结合元件序列为AGGGTGGGGC。高表达KLF4能抑制CRC中ARF6蛋白表达。4、研究结论:在CRC组织中,KLF4抑制ARF6蛋白表达,其分子机制可能是KLF4结合到ARF6启动子区发挥着转录抑制作用,进而抑制ARF6蛋白表达。第三部分ARF6通路分子在结直肠癌中的预后意义研究1、研究目的:探索ARF6通路上的家族分子、激活分子、抑制分子、效应分子等与CRC患者预后的关系。2、研究方法:ARF6通路分子分为5类:家族基因（ARFs）、鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factors,GEFs）、GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins,GAPs）、效应因子（Effectors）和ARF6抑制配体受体对（SLITs-ROBOs）。使用String在线工具构建蛋白相互作用网络（protein-protein interactions,PPI）。基于GEPIA数据库总生存率或无病生存率分析,并进一步用Human Protein Atlas数据库验证,查找蛋白在CRC组织中的表达。3、研究结果:（1）GEPIA数据库分析表明ARFs家族分子与CRC患者的预后均无明显相关性。（2）GEPIA数据库分析表明,ARF6 GEFs家族中的IQSEC3/GEP100与CRC患者的总生存率相关;Human Protein Atlas在线数据库尚无IQSEC3/GEP100数据信息。（3）GEPIA数据库分析表明ARF6 GAPs家族中的SMAP1、AGAP3与CRC患者的总生存率相关,AGAP1则与CRC患者的无病生存率相关;Human Protein Atlas在线数据库进一步证实SMAP1、AGAP3是CRC患者预后的重要影响分子。（4）GEPIA数据库分析表明,ARF6 effectors家族中的的MAPL8IP3/JIP3与CRC患者的无病生存率相关;Human Protein Atlas在线数据库进一步证实MAPL8IP3/JIP3是CRC患者预后的重要影响分子。（5）GEPIA数据库分析表明,SLITs-ROBOs家族中的SLIT1与CRC患者的总病生存率相关;Human Protein Atlas在线数据库尚无SLIT1数据信息。4、研究结论:ARF6通路分子中SMAP1、AGAP3、MAPL8IP3/JIP3是CRC患者预后标志物。
王婧雯[6]（2021）在《MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究》文中提出第一部分慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究研究背景乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）持续的感染是世界性的公共卫生问题,全球至少有2.57亿人有慢性HBV感染。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）会对肝脏造成损伤,随着疾病的发展会导致肝硬化甚至是肝癌,因此对CHB进行及时有效的治疗显得尤为重要。Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）是治疗CHB的一线药物。Ⅰ型IFN与细胞膜表面的Ⅰ型干扰素受体（type Ⅰ interferon receptor,IFNAR）的亚基IFNAR1和IFNAR2结合,形成异二聚体配体受体复合物,激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子1（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 1,JAK/STAT1）信号通路,产生抗病毒蛋白发挥抗病毒作用。Ⅰ型IFN还可以通过STAT1使MDM2转录下调来诱导p53蛋白的稳定以发挥抗病毒的作用。STAT1既是Ⅰ型IFN信号转导所必需的,同时也可以负调控鼠双微体2（mouse double minute-2,MDM2）,p53的降解和反式激活受到MDM2调控,抑制了 p53的表达作用。JAK/STAT1途径激活后,STAT1表达升高抑制了 MDM2的表达,p53表达增加增强了 Ⅰ型IFN抗病毒信号并促进HBV病毒感染细胞的凋亡,抑制HBV在细胞中的复制,发挥p53的先天抗病毒免疫作用。表观遗传学中有一类是DNA甲基化,是一种对DNA的化学修饰。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶作用下获得甲基基团,进而在不改变DNA序列的情况下影响基因表达。氧化应激是机体氧化状态和抗氧化状态的动态平衡被打破,更倾向于氧化状态。有研究指出氧化应激会引起表观遗传学改变,这可能与CHB的发生和发展有关。现在尚未有关于CHB患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态及与氧化应激关系的研究。研究目的1.明确 CHB 患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs 中 IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。2.明确CHB患者和HCs的PBMCs中IFNAR mRNA和MDM2 mRNA表达水平。3.研究CHB患者PBMCs中的INFAR启动子甲基化对MDM2 mRNA相对表达量的影响。4.研究CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化与氧化应激之间的关系。研究方法本研究共纳入169例研究对象,其中CHB患者148例,HCs 21例,于2014年1月到2016年10月在山东大学齐鲁医院肝病科入组。CHB的纳入标准按照 2009 年美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的《乙型肝炎指南》,乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）阳性时间至少6个月。甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）被用来检测 PBMCs 中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测 IFNAR mRNA 及 MDM2 mRNA 的相对表达量。酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血浆中丙二醛（malondialdehyde,MDA）和谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平。统计分析采用 SPSS 22.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 5.0 软件（San Diego,CA,USA）。连续变量的组间差异比较使用Mann-Whitney U检验。使用卡方检验来比较分类变量的组间差异。变量间的相关性使用的是Spearman等级相关检验。当p<0.05时,认为差异具有统计学的意义。研究结果1.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化的频率明显低于HCs（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p<0.001）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 启动子甲基化频率与HCs相比无明显差异（p>0.05）。2.CHB患者PBMCs中IFNAR mRNA表达量相较于HCs明显升高（IFNAR1:p=0.031;IFNAR2:p=0.027）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 mRNA 表达量与HCs相比无明显差异（p>0.05）。3.CHB患者中IFNAR启动子甲基化组IFNAR mRNA表达量相较于非甲基化组明显降低（IFNAR1:p=0.023;IFNAR2:p=0.044）。4.CHB患者中存在IFANR启动子甲基化的患者,其MDM2 mRNA相对表达量是明显高于IFNAR启动子非甲基化组中患者的相对表达量（IFNAR1:p=0.001,IFNAR2:p=0.008）。5.CHB患者血浆中的MDA是明显高于HCs,而GSH是低于HCs（MDA:p<0.001;GSH:p<0.001）。在CHB患者中IFNAR启动子甲基化组的MDA是明显高于非甲基化组（IFNAR1:p=0.018;IFNAR2:p=0.041）,GSH则是明显低于非甲基化组的（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p=0.029）。研究结论1.CHB患者PBMCs中IFNAR启动子是存在甲基化异常的,同时IFNAR启动子甲基化的频率是低于HCs。CHB患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的水平与HCs相比是没有差异的。2.CHB患者PBMCs中的IFNAR发生甲基化后,导致IFNAR mRNA相对表达量降低并伴有MDM2 mRNA表达量升高,提示IFNAR甲基化可能影响MDM2 mRNA的表达,两者可能共同影响Ⅰ型IFN抗病毒的效果。3.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化可能是与氧化应激有关系的,这或许为CHB中氧化应激诱导的表观遗传调控提供了新见解。第二部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究研究背景原发性肝癌中大约有90%是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。HCC是世界上最常见的癌症之一,其发病率在癌症的发病率中排第五位,在癌症死亡率中排第三位。在中国每年因肝癌死亡的约有38.3万人,约占到全球肝癌死亡人数的51%。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染、酒精性肝病、慢性丙型肝炎病毒感染及非酒精性脂肪性肝炎等是导致HCC发生的主要的危险因素。在中国,慢性乙型肝炎病毒感染导致的乙肝相关HCC最为常见。虽然现在的医疗技术不断发展、诊断水平得以提高、影像学检查手段更加完善,但由于HCC通常起病隐匿,发现时一般已处于中晚期,而手术切除和肝移植适用于治疗早期发现的HCC,大部分HCC患者会错过治疗的最佳时机。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）是最常用于诊断HCC的标志物,但是大约40%的HCC患者血清中AFP的水平并不升高,因此寻找更加灵敏且无创的生物标志物显得尤为重要。肿瘤发生发展的重要原因之一是DNA甲基化,虽然DNA的序列没有发生改变但是对基因表达的影响是可遗传的。DNA甲基化对基因表达非常重要,同时也会对细胞产生不良后果。DNA甲基化包括DNA高甲基化和DNA低甲基化,两者都是常见的表观遗传学特征。目前关于DNA低甲基化对机体产生的影响很少有研究。在大多数情况下,DNA低甲基化是指与“正常”甲基化水平相比有所降低,如和正常细胞或者组织进行比较,与基因表达的增加有关。DNA低甲基化在肿瘤中较为常见,如肝癌、胃癌、结肠癌和肺癌等。基因的低甲基化可作为诊断肿瘤的生物标志物。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）可以对p53肿瘤抑制因子进行负调控,可以泛素化降解p53,也可以结合p53的转录激活域以调节p53的表达。通常情况下,MDM2与p53之间存在可以自我调节的负反馈回路,以确保它们之间的动态平衡。然而,在肿瘤中该负反馈环通常被破坏。尤其是MDM2的过表达与多种肿瘤有关,如肉瘤、肝癌和胃癌。无论p53处于何种状态,过表达的癌蛋白MDM2不仅与p53结合并负调控p53,而且还有助于HCC的发生和进展。但是目前关于乙肝相关HCC患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中 MDM2 启动子甲基化状态以及诊断价值尚未有研究。研究目的本研究的主要目的是探讨乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态,以及对乙肝相关HCC的诊断价值。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的患者,包括100例乙肝HCC患者,31例肝硬化（liver cirrhosis,LC）患者以及37例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者,入组时间为2016年6月至2018年2月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发表的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且要求乙肝表面抗原阳性大于6个月。LC患者的入组条件根据《2015年日本胃肠病学会肝硬化循证医学临床实践指南》。2018年,AASLD中《慢性乙型肝炎的预防、诊断、治疗更新:AASLD 2018乙型肝炎指南》作为CHB患者的筛选标准。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA 的 相对表达量。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）、GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）和 MedCalc 软件（MedCalc,Ostend,Belgium）。使用Mann-Whitney U检验或者Kruskal-Wallis H检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。通过二分类logistic回归分析寻找影响MDM2启动子甲基化状态的危险因素。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理特征的相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。通过受试者工作特征曲线下面积（the area under the receiver operating characteristic curve,AUC）来评估MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合应用对于提高乙肝相关HCC诊断的价值。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.CHB患者中,PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率为72.97%（27/37）,在LC患者中的为64.52%（20/31）,在乙肝相关HCC患者中的为30.00%（30/100）。发现,乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化频率低于CHB（p=0.000）和LC（p=0.001）患者。MDM2启动子甲基化频率在CHB和LC患者是没有统计学差异的（p>0.05）。2.在乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的状态是与远处转移（p=0.040）、TNM 分期（p=0.035）及 BCLC 分期（p=0.044）有明显相关,而与性别、年龄、AFP、血管侵犯、淋巴结转移、肿瘤数量、肿瘤大小之间无相关性（p>0.05）。通过二分类logistic回归分析,结果显示各临床病理特征均不是MDM2启动子甲基化的危险因素（p>0.05）。3.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2 mRNA相对表达量明显高于LC（p=0.010）和 CHB（p=0.003）患者,CHB 和 LC 患者之间 MDM2 mRNA 相对表达水平是没有统计学差异的（p>0.05）。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.024）。4.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2 mRNA相对表达水平是与HBV DNA（p=0.009）、谷丙转氨酶（p=0.016）、谷草转氨酶（p=0.024）有显着相关性的,但是与总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间没有相关性（p>0.05）。5.区分乙肝相关HCC和CHB患者时,PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.756;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.639;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.715。区分乙肝相关HCC与LC患者时,MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.735;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.634;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.673。可见PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。研究结论乙肝相关HCC患者PMBCs中MDM2启动子低甲基化,并且PBMCs中MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。第三部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究研究背景肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种世界范围的发病率高和死亡率高的原发性肝癌。HCC的病因包括肝炎病毒感染（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒）、饮酒、代谢性肝病（尤其是非酒精性脂肪肝）。在中国,感染了慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）导致的乙肝相关HCC更为普遍。DNA低甲基化会导致癌基因的激活,是癌症发生和发展的主要危险因素。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）作为癌基因,在乙肝相关HCC患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中存在MDM2启动子低甲基化且MDM2表达量升高,但是导致MDM2启动子低甲基化的原因并不清楚。许多研究表明,氧化应激会导致基因表观遗传学的改变,其中就包括DNA甲基化状态的改变。氧化应激是机体氧化和抗氧化之间的动态平衡被打破,更倾向于氧化。通过对血浆中氧化剂和抗氧化剂的定量检测及检测相关代谢产物的代谢组学来评估氧化应激。代谢组学被定义为“对内源性代谢物的详尽分析”,已经在寻找疾病生物标志物、探讨癌症发生发展机制中得到广泛应用。代谢组学作为基因组学和蛋白质组学的补充,能更好的反映生物系统的病理生理状态的变化。目前关于乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子低甲基化和氧化应激的关系尚且没有研究。研究目的1.明确乙肝相关HCC患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和氧化应激的关系。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的117例乙肝相关HCC患者,和招募的26例HCs,入组时间为2016年6月至2019年8月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且乙肝表面抗原阳性大于6个月。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA的相对表达量。血浆中氧化参数丙二醛（malondialdehyde,MDA）和抗氧化参数超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）使用酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）。使用Mann-Whitney U检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理参数相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。选取研究对象中的36例乙肝相关HCC患者和11例HCs,通过超高液相色谱-质谱（ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UHPLC-MS）检测血浆中代谢物改变。代谢组学得到的数据通过SIMCA软件（V16.0.2,Umea,Sweden）进行处理,分别获得了主成分分析（principal component analysis,PCA）以及正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）。差异代谢物的筛选标准为OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度（variable importance for the projection,VIP）>1,p<0.05,组间物质定量比值（fold change）>2 或<0.5。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率是明显低于HCs（p<0.001）。对于乙肝相关HCC患者,MDM2启动子甲基化的状态是与TNM分期相关的（p=0.037）,但与性别、年龄、AFP、肿瘤数量、肿瘤大小、血管之间无明显相关性。2.在乙肝相关HCC患者中MDM2 mRNA表达量明显高于HCs（p<0.001）。通过分析发现,乙肝相关HCC患者MDM2 mRNA水平与HBV DNA（p=0.017）和 ALT（p=0.018）以及 AST（p=0.034）表现为正相关,但与 TBIL（p=0.072）、ALB（p=0.596）和PT（p=0.762）没有相关性。并且,在乙肝相关HCC患者中MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.027）。3.乙肝相关HCC患者血浆中氧化剂MDA水平明显高于HCs（p<0.001）,抗氧化剂SOD和GSH水平明显低于HCs（SOD:p=0.009;GSH:p=0.040）。同时,在乙肝相关HCC患者中,MDM2启动子非甲基化组氧化剂MDA水平明显高于甲基化组（p=0.027）,而抗氧化剂SOD和GSH水平低于甲基化组（SOD:p<0.001;GSH:p=0.017）。4.乙肝相关HCC患者血浆中代谢物的改变和HCs存在显着差异,差异代谢物共有216种。其中正离子模式中检测到的差异代谢物包含了 144种,上调的差异代谢物包含了 88种,下调的差异代谢物包含了 56种;负离子模式中检测到的差异代谢物包含了 72种,上调的差异代谢物包含了 51种,下调的差异代谢物包含了 21种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,胆汁酸,脂肪酸类,磷脂,糖类,有机酸类和有机杂环化合物及其他类化合物。5.乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组的差异代谢物是有明显区别的,差异代谢物包含了 81种。正离子模式包含有52种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有33种,降低的差异代谢物有19种;负离子模式中包含有29种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有19种,降低的差异代谢物有10种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,脂肪酸类,磷脂,胆汁酸,有机酸和其他类化合物。并且我们发现,在MDM2启动子甲基化组具有抗氧化作用的代谢物消退素D1、亮氨酸等明显高于MDM2启动子非甲基化组（p<0.05）,同时可以提供甲基的S-腺苷甲硫氨酸水平明显高于非甲基化组（p=0.029）,而与氧化损伤有关的代谢物吲哚硫酸盐、硫酸对甲酚等明显低于非甲基化组（p<0.05）。6.乙肝相关HCC患者和HCs血浆差异代谢物相比,发现主要涉及到了精氨酸和脯氨酸的代谢、精氨酸和鸟氨酸的代谢、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢、氮代谢。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组血浆差异代谢物相比,发现差异代谢物主要涉及到半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢、组氨酸的代谢、戊糖和葡糖醛酸的相互转化、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢。其中半胱氨酸和甲硫氨酸代谢是与乙肝相关HCC患者的MDM2启动子甲基化组和非甲基化组差异代谢物相关性最显着的代谢通路。研究结论1.MDM2启动子甲基化频率在乙肝相关HCC患者的PBMCs中是明显低于HCs。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子低甲基化状态与氧化应激有关,半胱氨酸和甲硫氨酸代谢可能在其中发挥重要作用。
巩丽[7]（2021）在《CUL4B在RAS基因诱导细胞衰老中的作用和机制探究》文中进行了进一步梳理[研究背景]细胞衰老是一种稳定的细胞周期停滞状态,其特征表现为形态改变、半乳糖苷酶活性上升、衰老相关分泌表型产生、衰老相关异染色质聚集等。端粒缩短、DNA损伤、炎症环境等多种因素均能引起细胞衰老。癌基因诱导的衰老（Oncogene-inducedsenescence,OIS）是重要的细胞衰老类型。现已明确,Ras、Raf、c-Myc等原癌基因激活或PTEN、NF1等抑癌基因失活均能诱导OIS发生。Ras基因在肿瘤发生中扮演重要角色,约30%肿瘤中携带Ras突变,Ras诱导的细胞衰老是OIS研究热点之一。细胞衰老在肿瘤早期发生发展中有重要作用,因此研究Ras诱导细胞衰老的调控机制对于寻找新的肿瘤治疗靶标和研发新疗法具有非常重要的意义。Cullin-4B（CUL4B）编码构成Cullin-RING E3泛素连接酶复合物（Cullin-RINGE3 ligases,CRLs）的支架蛋白CUL4B。Cullin4B-RING泛素连接酶复合物（CRL4B）通过催化不同底物泛素化广泛参与细胞周期、凋亡、信号转导等众多生命活动,在细胞增殖、细胞衰老和肿瘤发生中也发挥重要功能。已有研究表明CUL4B通过抑制p53-ROS正反馈通路进而抑制氧化应激诱导的细胞衰老过程,本实验室前期研究结果表明CUL4B促进癌基因c-Myc诱导的细胞衰老且该过程可能依赖于p53。[研究目的]CUL4B在癌基因RAS诱导细胞衰老中的具体作用及机制尚未明确,而RAS基因在肿瘤发生发展中发挥重要作用,基于以上研究背景,本课题的研究目的为:1.利用体内、体外实验探究CUL4B在癌基因RAS诱导细胞衰老中的具体作用。2.探究CUL4B调控癌基因RAS诱导细胞衰老的作用机制。[材料与方法]1.以正常人类成纤维细胞为实验材料,使用H-RASG12V组成性激活的腺病毒感染细胞,构建H-RAS诱导的细胞衰老模型。利用SA-β-gal衰老染色实验、EdU掺入实验及克隆形成实验验证衰老模型,利用Western Blot方法检测H-RAS诱导衰老细胞内CUL4B蛋白表达水平。2.构建CUL4B低表达及过表达的正常人类成纤维细胞系,感染H-RASG12V病毒后利用SA-β-gal衰老染色实验、EdU掺入实验及克隆形成实验检测CUL4B改变对癌基因H-RAS诱导细胞衰老的影响,探究CUL4B在癌基因H-RAS诱导细胞衰老中的作用。3.构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性激活KrasG12D的转基因小鼠（SPC-Cre;KrasG12D）;构建肺上皮特异性敲除Cul4b且肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性激活KrasG12D的转基因小鼠（SPC-Cre;Cul4bflox/flox;KrasG12D）。取3月龄小鼠肺组织制成冰冻切片进行SA-β-gal衰老染色,检测肺组织衰老情况,探究Cul4b敲除是否会影响SPC-Cre;KrasG12D转基因小鼠肺组织的衰老,利用体内实验分析CUL4B对Ras诱导衰老的影响。4.利用Western Blot方法检测CUL4B表达改变对H-RAS诱导的衰老细胞中衰老相关调控蛋白表达的影响。在C UL4B低表达及过表达细胞系中干扰p53表达,感染H-RASG12V病毒及对照病毒,利用SA-β-gal衰老染色方法检测细胞衰老,探究CUL4B促进H-RAS诱导细胞衰老过程是否依赖于p53;利用Western Bolt方法检测p21蛋白表达变化,探究CUL4B促进H-RAS诱导的p21表达是否依赖于p53,探究CUL4B促进H-RAS诱导细胞衰老的机制。[研究结果]1.SA-β-gal衰老染色、EdU掺入实验及克隆形成实验证实H-RAS诱导的细胞衰老模型构建成功,Western Blot结果显示H-RAS诱导的衰老细胞中CUL4B表达上调。2.SA-β-gal衰老染色、EdU掺入实验及克隆形成实验结果显示干扰CUL4B表达抑制H-RAS诱导的细胞衰老,促进增殖;过表达CUL4B促进H-RAS诱导的细胞衰老,抑制增殖。提示CUL4B促进RAS诱导的细胞衰老。3.转基因小鼠肺组织SA-β-gal衰老染色结果显示,处于肺癌发生初始阶段的SPC-Cre;KrasG12D小鼠肺部支气管上皮细胞及肺间质出现衰老阳性染色,显示肺上皮细胞衰老;Cul4b敲除小鼠SPC-Cre;Cul4bflox/flox;KrasG12D小鼠肺癌恶性程度更高,肺组织中衰老染色阳性率降低,敲除Cul4b抑制细胞衰老。这些结果提示CUL4B在体内也促进RAS诱导的衰老。4.Western Blot实验结果显示过表达CUL4B促进了 H-RAS诱导的p21升高。进一步研究揭示干扰p53表达不影响CUL4B促进的细胞衰老,并且干扰p53表达不影响CUL4B在转录后水平促进RAS诱导的p21表达。此外,研究发现CUL4B抑制miR-372表达,miR-372在转录后水平抑制H-RAS诱导的p21表达。[研究结论]通过以上研究,我们得出结论:H-RAS诱导CUL4B表达上调;CUL4B促进RAS诱导的细胞衰老;H-RAS激活后,CUL4B在转录后水平促进p21表达,并且该过程不依赖于p53;CUL4B抑制miR-372的表达,miR-372在转录后水平抑制H-RAS诱导的p21表达,提示CUL4B通过抑制miR-372表达在转录后水平促进p21的表达,促进RAS诱导的细胞衰老。本实验结果为进一步揭示CUL4B在RAS诱导细胞衰老中的作用机制提供了实验数据并为理解OIS以及肿瘤发生中的分子机制提供了参考。
曹治杰[8]（2021）在《PD-1在p53介导肿瘤抑制过程中的调控机制及生物学功能研究》文中进行了进一步梳理在肿瘤发生发展过程中,肿瘤抑制因子p53在调控肿瘤抑制方面发挥重要作用。越来越多的研究表明,p53介导的细胞周期阻滞、凋亡及衰老等经典的DNA损伤反应对于发挥p53肿瘤抑制作用并非完全必要。近年来发现p53在调控代谢、自噬、铁死亡及免疫等多种生物学过程中可能对肿瘤抑制起关键作用。但究竟何种生物学过程对于p53介导的肿瘤抑制起决定性作用仍尚未研究清楚,是否还有潜在的p53下游靶基因参与调控肿瘤抑制仍需进一步研究。基于这些问题,本研究围绕p53调控肿瘤抑制功能的分子机制展开研究,探索参与介导p53调控肿瘤生物学行为的潜在靶基因,寻找可靶向该靶点的药物以抑制肿瘤生长,为癌症治疗提供新的策略。为寻找参与调控p53介导肿瘤抑制的潜在靶基因,本研究通过RNA-seq筛选电离辐射后p53+/-和p53-/-小鼠的差异表达基因,生物信息学分析发现在DNA损伤情况下有超过300个p53依赖的差异表达基因,GO分析发现这些差异表达基因多与应激反应和细胞死亡相关。其中,我们意外发现PD-1参与细胞死亡、凋亡以及免疫等生物学过程,而目前关于p53与PD-1的研究还不清楚。本研究发现PD-1不仅表达于免疫细胞表面外,在肿瘤细胞中也有表达,而且在DNA损伤情况下激活p53后能够检测到肿瘤细胞和正常细胞中PD-1的mRNA和蛋白质水平的表达上调。通过ChIP、EMSA和Luciferase Reporter实验进一步证明,PD-1是p53的直接下游靶基因。由于在DNA损伤情况下,p53磷酸化和乙酰化主要影响p53转录活性,因此开展磷酸化和乙酰化p53调控PD-1的机制研究。我们发现位于p53 DNA结合区域的K120/164位点乙酰化对于p53介导的PD-1转录激活至关重要,而且介导K120/164乙酰化的乙酰基转移酶p300/CBP、TIP60有助于p53介导的PD-1转录。另外,p300/CBP、TIP60在乙酰化p53的招募下分别催化PD-1启动子附近的组蛋白H3K18/27、H4K16乙酰化,促进PD-1启动子区域染色质开放,从而促进PD-1转录激活。功能上,通过免疫全缺陷小鼠的荷瘤实验证明肿瘤细胞中过表达PD-1抑制肿瘤生长,该抑制作用不依赖于免疫调控,与肿瘤细胞AKT-mTOR信号通路抑制相关,而且敲减PD-1能显着削弱p53介导的肿瘤抑制。此外,组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）以乙酰化p53依赖的方式促进PD-1表达,并通过与p53协同作用进一步抑制肿瘤细胞生长。综上所述,本研究揭示了 p53及其乙酰化修饰调控肿瘤细胞内源性PD-1转录激活的分子机制,并表明肿瘤细胞p53-PD-1轴以免疫非依赖的方式调控肿瘤发生发展的生物意义。此外,本研究设计了应用HDACi联合p53激活肿瘤细胞内源性PD-1表达的方法以增强肿瘤抑制作用,从而为肿瘤治疗提供新的策略。
王奕智[9]（2021）在《USP4对胰腺癌恶性生物学行为的影响及其作用机制研究》文中指出研究背景胰腺癌起病隐匿,早期准确诊断方式匮乏,患者预后极差,发病率与死亡率相当,5年总体生存率仅约10%,因而被称为“癌中之王”。数十年来,尽管胰腺癌的发病率不断降低,但胰腺癌患者的死亡率仍居高不下,往往确诊时已是局部进展或出现远处转移。目前,根治性手术仍是治疗胰腺癌的主要手段,但适用根治性手术的患者却十分有限。以手术治疗为主,多学科治疗手段为辅的综合治疗方式是目前胰腺癌治疗的主流选择。泛素特异性蛋白酶4（Ubiquitin-specific protease4,USP4）作为一种底物广泛的去泛素化酶,既往已被报道能够参与诸多肿瘤的进展,而目前尚缺乏关于USP4在胰腺癌中作用的相关文献研究报道。本研究旨在利用临床病理组织样本及基础实验明确USP4在胰腺癌进展中所扮演的角色,探究USP4在胰腺癌患者中的预后价值,为胰腺癌的精准靶向治疗提供潜在治疗靶点,进而指导胰腺癌的个体化精准治疗。研究目的探究USP4在胰腺癌组织中的表达情况及预后价值;揭示USP4在胰腺癌细胞体外增殖、体内成瘤、迁移侵袭及化疗耐药等细胞表型中的调控作用;初探USP4调控胰腺癌恶性生物学行为的下游通路及具体作用机制。研究方法1.利用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色对人胰腺癌组织及正常胰腺组织中USP4的表达情况进行检测,并探讨USP4表达与胰腺癌患者临床病理学指标的相关性及其预后意义。2.利用小干扰 RNA（small interfering RNA,siRNA）在 MIA PaCa-2 和 AsPC-1 胰腺癌细胞株中瞬时敲减USP4,使用慢病毒转染筛选并建立稳定USP4敲减及过表达双向调节MIA PaCa-2和AsPC-1稳转细胞株。3.利用CCK-8细胞增殖实验、平板克隆形成实验及裸鼠皮下移植瘤模型检测USP4表达对胰腺癌细胞体外增殖及体内成瘤能力的影响;细胞划痕愈合实验、transwell小室迁移侵袭实验用来探究USP4表达对胰腺癌细胞体外迁移侵袭能力的影响;细胞毒性实验用来检测USP4表达水平变化后,胰腺癌细胞对吉西他滨化疗敏感性的改变情况;利用western blot实验分析检测USP4表达改变对细胞周期相关蛋白表达的影响。4.利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）、蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction,PPI）数据库STRING以及交互数据集的生物通用存储库（Biological General Repository for Interactive Datasets,BioGRID）、串联质谱标签（Tandem Mass Tag,TMT）标记定量的蛋白质组学分析预测胰腺癌细胞中受USP4可能调控的生物学过程、潜在相互作用蛋白以及可能的下游信号通路;利用western blot实验分析检测肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）受体相关蛋白6（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）及其下游NF-κB信号通路中关键蛋白的表达情况;利用IHC染色分析肿瘤组织中USP4与NF-κB信号通路中关键蛋白p65表达的相关性。5.利用环己亚胺蛋白质稳定性实验初探USP4对TRAF6的具体调控机制,进而使用在USP4稳转细胞株中瞬时敲减TRAF6的单向解救实验证明NF-κB信号通路在USP4诱导胰腺癌细胞恶性生物学行为的调控中所起的中介作用。6.本研究中所使用的统计学方法包括Mann-Whitney UU检验、χ2检验、Cox回归分析、Kaplan-Meier生存分析、Pearson相关性分析、Spearman相关性分析、Student’s t检验以及单因素方差分析（One-way ANOVA）。P值小于0.05被认为具有显着性差异。研究结果1.USP4在胰腺癌组织中的表达及其预后价值USP4在胰腺癌组织中的表达水平较正常胰腺组织显着升高（P<0.05）。USP4在胰腺癌组织中高表达与肿瘤组织分化较差显着相关（P<0.05）。单因素分析发现USP4表达水平与患者预后显着相关（P<0.05）,USP4高表达患者的疾病特异生存时间（Disease-specificsurvival,DSS）较 USP4 低表达患者明显缩短（P<0.05）。而在多因素分析中,USP4高表达是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素（P=0.048,HR=1.389）。2.USP4对胰腺癌细胞恶性生物学行为的调控相比正常胰腺导管上皮细胞株,USP4在多数胰腺癌细胞株中表达升高。瞬时敲减USP4表达可以抑制MIAPaCa-2和AsPC-1细胞株的体外增殖及迁移侵袭能力（P<0.05）,并且USP4表达改变还能相应影响细胞周期相关蛋白的表达水平;过表达USP4能够增强MIA PaCa-2和AsPC-1细胞株的体外增殖和迁移侵袭能力（P<0.05）。在MIA PaCa-2的USP4双向调节稳转细胞株中,USP4表达改变还能够影响胰腺癌细胞株的体内成瘤能力（P<0.05）,但USP4表达改变却并不影响胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性（P>0.05）。3.USP4对胰腺癌恶性生物学行为调控的作用机制利用GSEA生物信息学分析发现USP4的差异表达可导致胰腺癌中基因富集情况的显着改变（NOM p-value=0.000,FDR q-value=0.015）,而且,USP4 的差异表达也与肿瘤相关基因差异富集及对应肿瘤进展信号通路显着相关（NOMp-value=0.000,FDR q-value=0.026）。之后,本研究对MIA PaCa-2 USP4敲减稳转细胞株及其对照组细胞株进行了 TMT定量标记的蛋白质组学分析。通过对具有显着表达差异的蛋白分子进行GO富集分析提示USP4可能参与影响胰腺癌细胞中cyclin-CDK复合物及减数分裂细胞周期G1/S期过渡的转录调控的形成。而KEGG富集分析结果表明USP4表达可以显着影响细胞周期及肿瘤进展相关信号通路中相关蛋白的表达。Western blot实验验证结果则证明USP4的表达改变可以影响NF-κB信号通路关键蛋白的表达,IHC染色结果则表明在本研究纳入的胰腺癌组织样本中,USP4的表达水平与NF-κB信号通路中的关键蛋白p65的表达水平呈显着正相关（r=0.3718,P<0.0001）。利用Pearson相关性分析和Spearman相关性分析联合PPI数据库STRING和BioGRID,并结合既往文献报道的USP4可能产生相互作用的蛋白时发现,USP4与NF-κB信号通路上游重要调控分子TRAF6的表达具有显着相关性（P<0.05）。之后的western blot实验验证结果提示在MIAPaCa-2和AsPC-1细胞株中瞬时敲减USP4的表达,TRAF6表达水平、p65表达水平以及第536位点丝氨酸磷酸化的p65表达水平均明显降低,而TAK1、TRAF2、p53、β-catenin和TGF-βRI的表达水平并无显着变化。qRT-PCR实验结果提示敲减USP4表达并不能在mRNA水平调控TRAF6的表达。上述结果说明USP4在胰腺癌中可能不参与调控p53信号通路、Wnt/β-catenin信号通路及TGF-β信号通路,且USP4并不影响NF-κB信号通路上游TRAF2和TAK1的表达,而可能仅通过调控TRAF6的蛋白表达,从而激活NF-κB信号通路。进一步的CHX蛋白质稳定性实验发现USP4能够稳定TRAF6的蛋白表达（P<0.05）。在USP4过表达的稳转细胞株中进行瞬时敲减TRAF6的单向解救实验表明,敲减TRAF6后能显着逆转USP4过表达诱导的胰腺癌细胞增殖和迁移侵袭能力的增强,并逆转NF-κB信号通路的激活（P<0.05）。结论1.与正常胰腺组织相比,USP4在胰腺癌组织中的表达显着升高;USP4高表达与胰腺癌患者预后不良密切相关,是判断胰腺癌患者预后不良的独立危险因素。2.USP4可以促进胰腺癌细胞体内外的增殖成瘤,增强胰腺癌细胞的体外迁移侵袭能力。3.USP4可以通过稳定TRAF6的蛋白表达,抑制蛋白降解,激活NF-κB信号通路,从而诱导胰腺癌的恶性生物学行为。
曾芷筠[10]（2021）在《基于SIRT1通路探讨金线莲黄酮提取物对改善自然衰老小鼠记忆衰退的作用与机制》文中提出目的:金线莲（Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.）是一种传统的民间药物,含有丰富的黄酮类化合物,具有较强的体内外清除自由基的能力,对自然衰老小鼠的学习记忆有一定的改善作用。本文以金线莲黄酮提取物（Anoectochilus roxburghii flavonoid extract,ARF）延缓小鼠大脑衰老作为研究重点,探究其对神经细胞的保护作用和潜在的分子机制;并通过研究ARF对D-半乳糖（D-gal）诱导的神经细胞（SH-SY5Y）衰老模型的影响,以及比较在加入SIRT1抑制剂后,ARF对该细胞模型的影响,探究其神经保护作用是否依赖于对SIRT1的调控,旨在进一步深入研究ARF在体内外的抗衰老作用及机制。方法:1.将52只18月龄昆明自然衰老小鼠给予ARF（94.18和376.72mg/kg,BW）、维生素E（100 mg/kg,BW）和等量生理盐水（作为衰老模型组）,并取13只2月龄昆明小鼠给予等量生理盐水治疗（青年空白对照组）,灌胃给药8周。期间每7天观察并记录各组小鼠体重、外观、行为活动状态。给药7周后,进行自发活动（旷场实验）和Morris水迷宫的行为学试验后,小鼠在腹腔麻醉并心脏灌注后,颈椎脱臼处死。测定小鼠心脏、肝脏、胸腺以及脾脏的脏器指数;大脑皮质中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、单胺氧化酶（MAO）和乙酰胆碱酯酶（ACh E）的水平。采用HE、Nissl、SA-β-gal和TUNEL对海马组织进行染色,观察海马的病理学形态变化。采用Western blot检测海马组织的SIRT1、p53、p21以及凋亡相关分子表达水平。2.采用D-gal刺激SH-SY5Y细胞,建立神经细胞衰老模型。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测ARF对SH-SY5Y细胞的细胞毒作用,确定ARF给药剂量;测定D-gal诱导的SH-SY5Y细胞衰老模型中各给药组ROS水平,以及SRIT1和p53的蛋白表达;添加SIRT1抑制剂EX527后,测定D-gal诱导的SH-SY5Y细胞内各给药组ROS水平和SRIT1和p53的蛋白表达。结果:1.对自然衰老小鼠一般体征的影响:青年小鼠饮食正常,毛发有光泽,皮肤紧致富有弹性,且活动正常;与自然衰老小鼠相比,ARF低剂量（94.18 mg/kg,BW）和高剂量（376.72 mg/kg,BW）均能显着改善衰老小鼠饮食减退、皮肤毛色发黄、暗淡,皮肤松弛、弹性下降,且活动减少的情况。2.对自然衰老小鼠的大脑记忆衰退的影响:（1）水迷宫行为学试验:与青年小鼠比较,自然衰老小鼠的逃逸潜伏期、寻找目标平台的路程显着延长,穿越平台的次数与在目标象限逗留的时间则明显缩短;与自然衰老小鼠相比,ARF显着缩短了小鼠的逃逸潜伏期以及寻找平台的路程,提高小鼠穿越平台的次数和在目标象限逗留的时间。（2）对自然衰老小鼠脑部形态学影响（Nissl染色）:与青年小鼠相比,衰老小鼠海马CA1区的尼氏小体数目显着减少;与衰老小鼠相比,ARF各给药组均能明显提高CA1区尼氏小体的数目;（3）对小鼠大脑皮质内ACh-E水平影响:与青年组小鼠相比,自然衰老小鼠大脑皮质内ACh-E水平显着增加;与衰老小鼠组比较,ARF可显着降低各给药组小鼠大脑皮质内ACh-E水平。3.对自然衰老小鼠的脏器指数的影响:研究结果表明,与青年组相比较,自然衰老小鼠重要器官（心脏、肝脏）以及免疫器官（胸腺）的脏器指数显着降低,而脾脏脏器指数则显着上升;与自然衰老小鼠相比,ARF具有显着增加心脏、肝脏以及胸腺的脏器指数的作用,但未能降低脾脏的脏器指数。4.对自然衰老小鼠脑部氧化损伤的影响:（1）对自然衰老小鼠脑部形态学影响（HE、SA-β-gal染色）:HE染色结果显示,与青年组小鼠相比,自然衰老小鼠脑部海马CA1区的神经细胞排列紊乱、细胞核固缩深染;SA-β-gal染色结果也显示衰老小鼠海马CA1区的衰老细胞数目显着增加。与衰老组小鼠相比,ARF可改善海马的病理形态变化以及减少衰老细胞的数目。（2）对自然衰老小鼠脑部氧化应激的影响:与青年组小鼠相比,衰老小鼠大脑皮质内与氧化应激相关的ROS、MAO和氧化产物MDA的含量明显上升,抗氧化酶SOD活性显着下降。而与衰老小鼠相比,ARF显着降低了小鼠大脑皮质内ROS、MAO和MDA水平,显着提高SOD活性。5.对自然衰老小鼠脑部神经细胞凋亡的影响:（1）对自然衰老小鼠脑部形态学影响（TUNEL染色）:在TUNEL染色中,与青年小鼠相比较,自然衰老小鼠海马CA1区阳性细胞凋亡数目显着增多,而与衰老小鼠相比,ARF能显着减少海马CA1区神经细胞凋亡的数目。（2）对自然衰老小鼠海马组织内蛋白表达的影响:Western blot的结果显示,与青年小鼠相比,衰老小鼠海马内的SIRT1表达显着减少,同时p53、p21和凋亡标志物Caspaes-3均表达量上升以及凋亡相关的Bcl-2/Bax比值下降。而ARF低、高剂量均能显着上调SIRT1、Bcl-2的表达,降低p53、p21以及Bax以及Caspaes-3的表达。6.对D-gal诱导的SH-SY5Y衰老细胞模型氧化损伤的影响:与D-gal诱导衰老的模型组比较,ARF可显着提高SIRT1表达量以及下调p53表达,同时可降低细胞内的ROS水平。而在添加SIRT1抑制剂EX527后,与各给药组比较,ARF无提高ROS的含量,且无上调SIRT1以及降低p53表达和ROS的含量的作用。结论:1.ARF对18月龄自然衰老小鼠具有一定延缓衰老的作用,包括改善由衰老引起的一般体征变化、行为活动减弱、重要器官（心脏、肝脏）以及免疫器官（胸腺）萎缩,但未能改善由衰老引起的脾脏肿大病变。2.ARF具有改善自然衰老小鼠学习与记忆作用,可能与其能减少尼氏小体的流失、抑制ACh-E活性有关。3.ARF对自然衰老小鼠的脑部氧化损伤具有保护作用,可能与其改善海马神经细胞病理形态、减少衰老细胞的形成、氧化应激和MAO的形成,以及调节抗氧化酶类系统有关。4.ARF对自然衰老小鼠的神经细胞的保护作用与调控SIRT1和抑制细胞凋亡有关。其机制是通过激活SIRT1表达,抑制p53、p21,进而提高抑凋亡蛋白Bcl-2表达,以及抑制促凋亡蛋白Bax和凋亡标志物Caspaes-3的表达,从而抑制神经细胞凋亡。5.ARF可改善SH-SY5Y细胞因D-gal诱导所产生的氧化应激损伤。其对神经细胞的保护作用与上调SIRT1表达、抑制p53蛋白表达有关,并依赖于对SIRT1的调控。
二、ARF蛋白——p53蛋白的重要调控因子（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、ARF蛋白——p53蛋白的重要调控因子（论文提纲范文）
（1）PEDVN蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 PED的概述 |
| 1.1.1 流行病学 |
| 1.1.2 临床症状及病理变化 |
| 1.1.3 PEDV生物学特性 |
| 1.2 细胞周期调控的研究进展 |
| 1.2.1 细胞周期的概述 |
| 1.2.2 细胞周期的调控 |
| 1.3 p53 与细胞周期 |
| 1.3.1 p53 与细胞周期调控 |
| 1.3.2 p53-DREAM与细胞周期调控 |
| 1.4 冠状病毒感染与细胞周期 |
| 1.4.1 冠状病毒感染与细胞周期调控 |
| 1.4.2 冠状病毒N蛋白与细胞周期调控 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、菌株、细胞 |
| 2.1.2 血清、载体 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 试剂配方 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 RNA 的提取及c DNA 的合成 |
| 2.2.2 基因扩增 |
| 2.2.3 重组质粒的构建及大量制备 |
| 2.2.4 原核表达、纯化及去标签化 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.7 间接免疫荧光(IFA) |
| 2.2.8 Western blotting |
| 2.2.9 流式细胞术 |
| 2.2.10 细胞周期同步化 |
| 2.2.11 接种病毒及TCID50 检测 |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.2.13 激光共聚焦 |
| 2.2.14 重组慢病毒的构建 |
| 2.2.15 分子对接分析 |
| 2.2.16 生物膜干涉技术(BLI)分析 |
| 2.2.17 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.2.18 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞确证以及对病毒复制的影响 |
| 3.1.1 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞的确证 |
| 3.1.2 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞对PEDV复制的影响 |
| 3.2 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞分子机制研究 |
| 3.2.1 PEDV N蛋白通过激活p53-DREAM信号通路引起Vero E6 细胞S期阻滞 |
| 3.2.2 PEDV N 蛋白诱导Vero E6 细胞S期阻滞依赖于N 蛋白和p53 核共定位 |
| 3.2.3 PEDV N蛋白通过与p53 相互作用介导Vero E6 细胞S期阻滞 |
| 3.3 基于PEDV N蛋白介导S期阻滞机制的抗病毒药物设计 |
| 3.3.1 抑制PEDV N蛋白与p53 相互作用小分子药物的筛选 |
| 3.3.2 筛选的小分子药物拮抗PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞的确证 |
| 3.3.3 金丝桃苷对PEDV复制抑制作用 |
| 3.4 PEDV N蛋白介导S期阻滞分子机制在仔猪肠道细胞IPEC-J2 上验证 |
| 3.4.1 PEDV N蛋白对IPEC-J2 细胞S期阻滞的确证以及对病毒复制的影响 |
| 3.4.2 PEDV N蛋白通过p53-DREAM信号通路介导IPEC-J2 细胞S期阻滞的验证 |
| 3.4.3 金丝桃苷拮抗PEDV N蛋白介导IPEC-J2 细胞S期阻滞抑制病毒复制的验证 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）LncRNA MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴调控依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:LncMEG3 促进依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老 |
| 1 前言 |
| 1.1 细胞衰老 |
| 1.2 Lnc RNA-MEG3 |
| 1.3 立题依据 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 主要溶液配制 |
| 2.2.3 依托泊苷诱导A549 及MCF-7 细胞衰老 |
| 2.2.4 Western blot检测目的蛋白的表达水平 |
| 2.2.5 qRT-PCR检测目的基因mRNA的表达水平 |
| 2.2.6 SA-β-gal衰老染色 |
| 2.2.7 si RNA转染 |
| 2.2.8 质粒转染 |
| 2.3 GEO数据下载 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 低剂量依托泊苷可以诱导A549 及MCF-7 细胞衰老 |
| 3.2 使用不同方法验证依托泊苷诱导的A549 及MCF-7 细胞衰老模型 |
| 3.3 LncMEG3 在肿瘤细胞衰老模型中表达升高 |
| 3.4 LncMEG3 可以调控肿瘤细胞衰老 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:LncMEG3 通过miR-16-5p/VGLL4 轴调控肿瘤细胞衰老过程 |
| 1 前言 |
| 1.1 Micro RNA-16-5p |
| 1.2 VGLL4 |
| 1.3 VGLL4 作为共转录因子与YAP竞争性结合下游转录因子 |
| 1.4 立题背景 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 主要溶液配制 |
| 2.2.3 依托泊苷诱导A549 及MCF-7 细胞衰老 |
| 2.2.4 Western blot检测目的蛋白的表达水平 |
| 2.2.5 qRT-PCR检测目的基因m RNA的表达水平 |
| 2.2.6 SA-β-gal衰老染色 |
| 2.2.7 siRNA转染 |
| 2.2.8 质粒转染 |
| 2.2.9 免疫荧光 |
| 2.2.10 双荧光素酶报告基因系统 |
| 2.2.11 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提 |
| 2.3 Starbase数据库的使用 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 共转录因子VGLL4 在肿瘤细胞衰老过程中在细胞核内及总表达水平均上调 |
| 3.2 在肿瘤细胞衰老过程中,lnc MEG3 通过发挥海绵效应,调控miR-16-5p的表达 |
| 3.3 MiR-16-5p参与了肿瘤细胞衰老过程 |
| 3.4 VGLL4 在肿瘤细胞衰老过程中是miR-16-5p的直接靶基因 |
| 3.5 VGLL4 参与了肿瘤细胞衰老过程的调控 |
| 3.6 在肿瘤细胞衰老过程中VGLL4 的表达水平受lnc MEG3 的调控 |
| 3.7 在依托泊苷诱导的A549及MCF-7 细胞衰老模型中,lnc MEG3 通过miR5p/VGLL4 轴发挥调控作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 LncRNAs与细胞衰老的相关性及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 Toll样受体的免疫调控机制及其所介导的肿瘤细胞死亡方式 |
| 2.1 Toll样受体 |
| 2.2 基于TLRs的免疫调节机制 |
| 2.2.1 肿瘤微环境的免疫平衡 |
| 2.2.2 TLRs对抗原提呈细胞的免疫调节机制 |
| 2.2.3 TLRs对巨噬细胞的免疫调节机制 |
| 2.3 TLRs所介导的细胞死亡的作用机制 |
| 2.4 TLRs在肿瘤治疗中的临床试验研究 |
| 2.4.1 TLR2 相关的临床研究 |
| 2.4.2 TLR3 相关的临床研究 |
| 2.4.3 TLR4 相关的临床研究 |
| 2.4.4 TLR5 相关的临床研究 |
| 2.4.5 TLR7/8 相关的临床研究 |
| 2.4.6 TLR9 相关的临床研究 |
| 2.4.7 传统抗肿瘤治疗对TLR通路的影响 |
| 2.5 总结和展望 |
| 第3章 材料和方法 |
| 3.1 主要仪器设备 |
| 3.2 主要耗材 |
| 3.3 主要抗体列表 |
| 3.3.1 流式抗体列表 |
| 3.3.2 Western Blot抗体列表 |
| 3.4 主要试剂 |
| 3.5 临床样本 |
| 3.5.1 研究对象 |
| 3.5.2 纳入标准 |
| 3.5.3 排除标准 |
| 3.5.4 资料收集及分组 |
| 3.5.5 随访 |
| 3.6 细胞系及培养条件 |
| 3.7 CpG基序的单链脱氧寡核苷酸(CpG ODNs)的制备 |
| 3.8 RNA提取、逆转录条件 |
| 3.9 普通PCR和实时定量PCR |
| 3.10 主要引物序列 |
| 3.11 细胞凋亡测定 |
| 3.12 细胞周期测定 |
| 3.13 细胞表面及细胞胞内蛋白测定 |
| 3.14 蛋白印迹试验 |
| 3.15 蛋白纯化及免疫沉淀 |
| 3.16 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测 |
| 3.17 信号通路抑制剂 |
| 3.18 免疫荧光共聚焦显微镜成像 |
| 3.19 急性B淋巴细胞白血病NCG小鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.20 CT26 小鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 3.21 小鼠全身免疫微环境的测定 |
| 3.22 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 TLR9在B-ALL患者PBMC中的表达情况 |
| 4.2 TLR9 的表达与B-ALL患者预后的相关性 |
| 4.3 B-ALL细胞系的选择及鉴定 |
| 4.4 TLR9 激动剂——CpG 685对B-ALL细胞系的体外效应 |
| 4.5 CpG 685 对小鼠肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.6 CpG 685 诱导BLIN-1 细胞凋亡的分子机制 |
| 4.6.1 CpG 685 激活BLIN-1 细胞中的TLR9 下游信号通路 |
| 4.6.2 CpG 685 通过P38 MAPK信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.3 CpG 685 通过JNK/C-MYC信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.4 C-MYC过表达对CpG 685 诱导的BLIN-1 细胞凋亡至关重要 |
| 4.7 不同类型B-ALL对 CpG 685 具有异质性的影响因素 |
| 4.8 Sup-B15 细胞系对CpG 685 耐药的机制 |
| 4.9 联合应用CpG 685 和伊马替尼逆转单药耐药的分子机制 |
| 4.10 联合应用CpG 685 和伊马替尼对Sup-B15 移植瘤小鼠的肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.11 CpG 685 对原代B-ALL细胞的反应性 |
| 4.12 CpG ODN对小鼠机体免疫状态的调控 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果及奖励 |
| 致谢 |
（4）CDC6调节脑胶质瘤细胞增殖和侵袭及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文名称及缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述：CDC6的生物学特性及在肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文 |
（5）结直肠癌中ARF6表达的临床意义及其通路分子的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 主要材料和仪器 |
| 前言 |
| 一、结直肠癌 |
| 二、ARF6 概述 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ARF6 在结直肠癌中的表达及临床意义研究 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 结直肠癌中ARF6 上游调控因子的研究 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ARF6 通路分子在结直肠癌中的预后意义研究 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 综述 ARF6在实体肿瘤演进中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
（7）CUL4B在RAS基因诱导细胞衰老中的作用和机制探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文情况 |
| 原始数据 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）PD-1在p53介导肿瘤抑制过程中的调控机制及生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 小鼠 |
| 1.1.2 细胞系 |
| 1.1.3 质粒 |
| 1.1.4 菌株 |
| 1.1.5 Oligo |
| 1.1.6 引物 |
| 1.1.7 抗体 |
| 1.1.8 试剂 |
| 1.1.9 仪器 |
| 1.1.10 溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 1.2.2 稳转细胞系的构建 |
| 1.2.3 单克隆细胞株筛选及鉴定 |
| 1.2.4 CRISPR/CAS9敲除细胞株的构建 |
| 1.2.5 慢病毒敲减细胞系的构建 |
| 1.2.6 MEF细胞原代培养 |
| 1.2.7 细胞生存率实验 |
| 1.2.8 流式细胞术 |
| 1.2.9 细胞凋亡实验 |
| 1.2.10 细胞增殖实验 |
| 1.2.11 克隆形成实验 |
| 1.2.12 质粒构建、鉴定及提取 |
| 1.2.13 荧光素酶报告基因实验 |
| 1.2.14 电泳迁移率实验 |
| 1.2.15 RNA提取、逆转录和实时定量荧光PCR |
| 1.2.16 RNA衰减分析实验 |
| 1.2.17 转录组测序 |
| 1.2.18 蛋白质免疫印迹 |
| 1.2.19 蛋白质免疫共沉淀 |
| 1.2.20 细胞组分分离实验 |
| 1.2.21 染色质免疫沉淀 |
| 1.2.22 免疫荧光实验 |
| 1.2.23 质谱样品制备 |
| 1.2.24 小鼠荷瘤实验 |
| 1.2.25 免疫组织化学染色方法 |
| 1.2.26 生物信息学分析 |
| 1.2.27 数据分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 正常细胞和肿瘤细胞中p53调控PD-1表达 |
| 2.1.1 筛选参与p53介导肿瘤抑制的潜在靶基因 |
| 2.1.2 肿瘤细胞中表达PD-1 |
| 2.1.3 肿瘤细胞中p53参与调控PD-1表达 |
| 2.1.4 小鼠组织及MEF细胞中Pd-1的表达依赖于p53 |
| 2.2 PD-1是p53的直接下游靶基因 |
| 2.2.1 p53与PD-1启动子区域存在结合 |
| 2.2.2 p53特异性结合PD-1启动子并驱动基因表达 |
| 2.3 乙酰化有助于p53介导PD-1的转录激活 |
| 2.3.1 p53 TAD磷酸化修饰和CTD乙酰化修饰不影响PD-1转录激活 |
| 2.3.2 p53 DBD乙酰化修饰对PD-1转录激活至关重要 |
| 2.3.3 生理状态下的p53 DBD区域的乙酰化修饰有助于PD-1转录激活 |
| 2.3.4 p53 K120/164位点的乙酰化修饰是伴随p53激活的主要翻译后修饰 |
| 2.4 p53与乙酰基转移酶相互作用调控PD-1表达 |
| 2.4.1 过表达乙酰基转移酶p300/CBP或TIP60增强p53介导的PD-1转录 |
| 2.4.2 敲减乙酰基转移酶p300、CBP或TIP60削弱p53介导的PD-1转录 |
| 2.4.3 乙酰化p53增强PD-1局部染色质区域招募p300、CBP或TIP60 |
| 2.5 肿瘤细胞中PD-1以免疫非依赖形式通过AKT/mTOR通路抑制肿瘤生长 |
| 2.5.1 肿瘤细胞中过表达PD-1不影响细胞生存和基础水平凋亡 |
| 2.5.2 肿瘤细胞中过表达PD-1以免疫非依赖形式抑制肿瘤生长 |
| 2.5.3 肿瘤细胞PD-1通过AKT/mTOR通路抑制肿瘤生长 |
| 2.6 肿瘤内源性PD-1的激活参与p53依赖的肿瘤抑制 |
| 2.6.1 敲减PD-1显着削弱p53介导的肿瘤抑制 |
| 2.6.2 激活肿瘤内源性PD-1表达增强p53介导的肿瘤抑制 |
| 3 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤抑制因子P53生物学功能及分子机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）USP4对胰腺癌恶性生物学行为的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第一部分 USP4在胰腺癌中的表达及其预后意义探究 |
| 第二部分 USP4对胰腺癌恶性生物学行为影响的研究 |
| 第三部分 USP4对胰腺癌恶性生物学行为影响的机制初探 |
| 讨论 |
| 局限和展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 USP4 function and multifaceted roles in cancer:a possible and potential therapeutic target |
| References |
| 攻读学位期间取得的研究成果及奖励 |
| 致谢 |
（10）基于SIRT1通路探讨金线莲黄酮提取物对改善自然衰老小鼠记忆衰退的作用与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 中药黄酮类化合物抗衰老作用研究进展 |
| 1.1.1 基于现代衰老学说研究中药黄酮类化合物的抗衰老作用 |
| 1.1.2 基于信号通路的中药黄酮类化合物抗衰老作用的研究 |
| 1.2 金线莲药理作用的研究进展 |
| 1.2.1 抗氧化作用 |
| 1.2.2 增强免疫作用 |
| 1.2.3 抗衰老作用 |
| 1.2.4 降脂保肝作用 |
| 1.2.5 抗癌作用 |
| 1.3 研究意义 |
| 第二章 金线莲黄酮提取物对自然衰老小鼠抗衰老作用的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试验药物 |
| 2.1.2 动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 金线莲黄酮提取物的制备 |
| 2.2.2 ARF的黄酮含量测定 |
| 2.2.3 剂量设计 |
| 2.2.4 动物分组与给药 |
| 2.2.5 ARF对自然衰老小鼠一般体征的影响 |
| 2.2.6 ARF对自然衰老小鼠学习与记忆的影响 |
| 2.2.7 ARF对自然衰老小鼠脏器指数的影响 |
| 2.2.8 数据统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ARF的黄酮含量测定 |
| 2.3.2 ARF对自然衰老小鼠一般体征的影响 |
| 2.3.3 ARF对自然衰老小鼠脏器指数的影响 |
| 2.3.4 ARF对自然衰老小鼠学习与记忆的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 ARF对自然衰老小鼠的一般体征以及对多个脏器脏器指数的影响 |
| 2.4.2 ARF对改善自然衰老小鼠大脑的记忆衰退的作用 |
| 第三章 金线莲黄酮提取物对于自然衰老小鼠脑部氧化损伤的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 试验药物 |
| 3.1.2 动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ARF对自然衰老小鼠脑部海马CA1区形态学的影响 |
| 3.2.2 ARF对自然衰老小鼠脑组织中ROS含量的影响 |
| 3.2.3 ARF对自然衰老小鼠脑组织中MDA的含量以及SOD、MAO的活力的影响 |
| 3.2.4 数据统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ARF对自然衰老小鼠脑部海马CA1区形态学的影响 |
| 3.3.2 ARF对自然衰老小鼠脑组织中ROS含量的影响 |
| 3.3.3 对自然衰老小鼠脑组织中MDA的含量以及SOD、MAO的活力的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 ARF对自然衰老小鼠海马神经元细胞形态学的影响(HE染色) |
| 3.4.2 ARF对自然衰老小鼠脑部氧化损伤的保护作用 |
| 第四章 金线莲黄酮提取物通过调控SIRT1抑制自然衰老小鼠海马神经元凋亡 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 试验药物 |
| 4.1.2 动物 |
| 4.1.3 主要试剂以及抗体 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 ARF对自然衰老小鼠凋亡海马神经细胞的影响 |
| 4.2.2 Westernblot法检测自然衰老小鼠海马区凋亡蛋白的表达 |
| 4.2.3 数据统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 ARF对自然衰老小鼠海马神经细胞凋亡的影响 |
| 4.3.2 对自然衰老小鼠海马区凋亡蛋白的表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 ARF对自然衰老小鼠海马神经元细胞凋亡的影响(TUNEL染色) |
| 4.4.2 ARF对自然衰老小鼠海马组织中的SIRT1、p53的影响 |
| 4.4.3 ARF对自然衰老小鼠海马组织中p21、Bcl-2、Bax以及Caspase-3表达的影响 |
| 第五章 金线莲黄酮提取物调控SIRT1对D-半乳糖诱导SH-SY5Y细胞衰老保护作用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 试验药物 |
| 5.1.2 细胞 |
| 5.1.3 主要试剂以及抗体 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 SH-SY5Y细胞的复苏、培养与传代 |
| 5.2.2 ARF对SH-SY5Y细胞存活率的影响(CCK-8法) |
| 5.2.3 SH-SY5Y细胞的给药 |
| 5.2.4 ARF对D-gal SH-SY5Y细胞中ROS含量的影响 |
| 5.2.5 Westernblot法检测SH-SY5Y中SIRT1、p53表达 |
| 5.2.6 数据统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 不同浓度的ARF对 SH-SY5Y细胞存活率的影响 |
| 5.3.2 ARF对D-gal SH-SY5Y细胞内ROS的影响 |
| 5.3.3 ARF对D-gal SH-SY5Y细胞内SIRT1、p53表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 ARF对D-gal诱导SH-SY5Y细胞衰老模型的氧化损伤的影响 |
| 5.4.2 ARF对D-gal诱导SH-SY5Y细胞衰老模型内SIRT1、p53表达的影响 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
四、ARF蛋白——p53蛋白的重要调控因子（论文参考文献）
- [1]PEDVN蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制[D]. 苏明俊. 黑龙江八一农垦大学, 2021(01)
- [2]LncRNA MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴调控依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老[D]. 陶冶. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究[D]. 白玲. 吉林大学, 2021(01)
- [4]CDC6调节脑胶质瘤细胞增殖和侵袭及其作用机制研究[D]. 赵浩. 山东大学, 2021(11)
- [5]结直肠癌中ARF6表达的临床意义及其通路分子的研究[D]. 孙耀华. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [6]MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究[D]. 王婧雯. 山东大学, 2021(12)
- [7]CUL4B在RAS基因诱导细胞衰老中的作用和机制探究[D]. 巩丽. 山东大学, 2021(09)
- [8]PD-1在p53介导肿瘤抑制过程中的调控机制及生物学功能研究[D]. 曹治杰. 北京协和医学院, 2021(02)
- [9]USP4对胰腺癌恶性生物学行为的影响及其作用机制研究[D]. 王奕智. 北京协和医学院, 2021(02)
- [10]基于SIRT1通路探讨金线莲黄酮提取物对改善自然衰老小鼠记忆衰退的作用与机制[D]. 曾芷筠. 广东药科大学, 2021(02)