延边白鹅CD4、CD8基因的克隆及SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的建立

论文摘要

CD4、CD8分子是T淋巴细胞表面的抗原受体,属于白细胞分化抗原,参与T细胞活化及抗原提呈。CD4、CD8分子分别于MHCII、MHCI型分子结合,保障T细胞与所结合靶细胞之间的联系牢固,是动物机体重要的免疫过程。通过对CD4与CD8分子的克隆及检测可以观测到动物机体细胞免疫水平。本次试验旨在完成延边白鹅的CD4、CD8基因的克隆、生物信息学分析以及建立CD4、CD8基因的SYBR Green I荧光定量PCR方法。首先完成延边白鹅CD4、CD8基因的克隆,为了得到两对基因的克隆片段,此试验参照GenBank发表的JQ272858、JQ272859两对基因组序列设计扩增CD4、CD8基因两对引物,分别在延边白鹅血液中以及延边白鹅七日龄小鹅的胸腺中分离T淋巴细胞并提取细胞内mRNA,将所提取的mRNA反转录为cDNA,利用设计引物在cDNA内克隆CD4、CD8基因,鉴定及测序正确后,对所得结果进行了初步生物信息学分析。结果显示,此实验成功克隆得到了片段大小分别为1 443bp的延边白鹅CD4分子以及片段大小为711bp的延边白鹅CD8分子。蛋白质的三级结构预测显示,延边白鹅的CD4蛋白所编码的480个氨基酸以及延边白鹅CD8蛋白所编码的236氨基酸均形成了较复杂的高级结构。其次,本着建立高效、快速、灵敏度高的PCR方法的原则,本次试验选择了SYBR Green I real-time PCR方法。将成功克隆的延边白鹅CD4、CD8基因作为模板,设计以克隆基因组内片段为目地的特异性引物,分别得到片段大小为121bp的CD4片段和119bp的CD8片段,并将克隆所得序列连接在pMD-18T上作为阳性标准品。此次试验最终建立了定量检测CD4、CD8基因的SYBR Green I real-time PCR方法。结果说明,本方法线性关系好,相关系数仅为0.999;敏感性强,是普通PCR灵敏度的100倍;重复性强,组内组间的变异系数均在2以下。是检测鹅CD4、CD8基因数量良好方法。综上所述,本次试验成功的克隆了延边白鹅的CD4、CD8基因,并成功的对二者进行了生物信息学分析。成功的建立了高效、快速、灵敏度高的SYBRGren I荧光定量PCR方法。本次试验为将来在延边白鹅CD4、CD8分子的单克隆抗体的研制奠定基础,为检测CD4、CD8在体内细胞免疫水平表达含量提高方法,同时也为其他免疫分子的克隆及检测方法的研究提供了借鉴。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
•   1. CD4、CD8分子的概述
•     1.1 CD4、CD8分子简介
•     1.2 T淋巴细胞简介
•   2. CD4、CD8分子特性
•     2.1 CD4分子特性
•     2.2 CD8分子特性
•   3. 不同种类聚合酶链式反应之间的比较
•     3.1 普通聚合酶链式反应
•     3.2 荧光聚合酶链式反应技术
•   4. 试验研究目的与意义
• 材料与方法
•   1 材料
•     1.1 实验动物
•     1.2 主要试剂
•     1.3 试验主要仪器及设备
•     1.4 实验室配制溶液
•   2. 方法
•     2.1 引物的设计与合成
•     2.2 细胞中mRNA的提取
•     2.3 mRNA的反转录
•     2.4 延边白鹅CD4、CD8基因的克隆
•     2.5 PCR产物的纯化回收
•     2.6 延边白鹅CD4、CD8基因的TA克隆
•     2.7 转化
•     2.8 克隆质粒的提取及鉴定
•     2.9 CD4、CD8的生物信息学分析
•     2.10 阳性标准质粒的制备
•     2.11 CD4、CD8荧光定量PCR方法的建立反应体系及条件的优化
• 结果
•   1. 延边白鹅CD4、CD8基因的扩增
•   2. 延边白鹅CD4、CD8核苷酸组分分析及核苷酸序列同源性分析
•   3. 延边白鹅CD4、CD8基因组的氨基酸序列同源性分析
•   4. 延边白鹅CD4、CD8蛋白的三级结构预测
•   5. 阳性标准质粒的制备
•   6. 溶解曲线
•   7. 荧光定量PCR标准曲线的建立
•   8. 敏感性试验
•     8.1 荧光定量PCR的敏感性检测
•     8.2 普通PCR的敏感性检测
•   9. 重复性试验
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王美洪

导师: 高旭,丁德

关键词: 延边白鹅,克隆,荧光定量

来源: 延边大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 延边大学

分类号: Q78

总页数: 45

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