产普鲁兰酶菌株的筛选、基因克隆表达及酶学性质研究

论文摘要

普鲁兰酶（Pullulanase,EC 3.2.1.41）是一种淀粉脱支酶,能够专一性地作用于普鲁兰糖、支链淀粉、极限糊精中的α-l,6糖苷键,切下整个侧枝,形成直链淀粉,是淀粉加工业中的关键酶,在食品、酿造、医疗、化工等行业中也有着极大的应用需求。本研究以淀粉厂污水为原料,旨在筛选出产普鲁兰酶优势菌株,对其进行菌种鉴定,克隆出其普鲁兰酶基因并通过异源表达提高其发酵水平,研究纯化后的重组酶的酶学性质,对国内普鲁兰酶的开发和应用具有重要意义。主要研究内容如下:（1）通过以支链淀粉为唯一碳源进行初筛,普鲁兰糖培养基进一步鉴定,结合酶活力测定,从淀粉厂污水中分离筛选出一株产普鲁兰酶活力较高的菌株LK18（1.53±0.16 U/mL）。通过形态特征观察、生理生化试验、16S rDNA序列同源性分析及系统进化树构建等方法,将其鉴定为Paenibacillus puldeungensis,并命名为Paenibacillus puldeungensis LK18。（2）选取与Paenibacillus puldeungensis LK18的16S rDNA同源性较高的菌株的普鲁兰酶蛋白序列进行多序列比对,通过CODEHOP法设计兼并引物,扩增出部分普鲁兰酶编码序列。然后根据该段基因序列的比对结果,进一步设计引物扩增出全长序列pulA,该基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过生物信息学分析,该酶为I型普鲁兰酶,属于糖苷水解酶13家族。（3）构建重组表达载体pET-28a（+）-pulA,在E.coli BL21（DE3）中进行异源表达并初步探索其诱导条件,结果显示:在22℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导12 h,该重组酶的表达效果最好,酶活力可达248.52 U/mL。（4）通过镍柱亲和层析对最优诱导条件下的粗酶液进行纯化,成功分离出重组蛋白,其分子量约为76.95 kDa,测定出重组酶的比酶活达508.8 U/mg。酶学性质研究表明:该重组酶的最适反应温度为45℃,最适pH为6.0,在35℃40℃或pH 6.08.0条件下较为稳定。10 mmol/L的K+和Mg2+对该重组酶有激活作用,Zn2+、Ni2+、Fe2+、Cu2+等对其有不同程度的抑制作用,其他离子对该酶无明显作用。以普鲁兰糖为底物时,该酶的Km值和Vmax值分别为3.69 mg/mL和384.62μmol/（min·mL）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 淀粉酶概述
•   1.2 普鲁兰酶概述
•     1.2.1 普鲁兰酶的定义和分类
•     1.2.2 普鲁兰酶的产生菌种
•     1.2.3 普鲁兰酶的结构与催化机理
•   1.3 普鲁兰酶的研究进展
•     1.3.1 普鲁兰酶的诱变育种
•     1.3.2 普鲁兰酶的异源表达研究
•     1.3.3 普鲁兰酶蛋白改造研究
•   1.4 普鲁兰酶的应用
•     1.4.1 Ⅰ型普鲁兰酶的应用
•     1.4.2 Ⅱ型普鲁兰酶的应用
•   1.5 本课题的具体研究目的、内容和意义
•     1.5.1 本课题的研究目的
•     1.5.2 本课题的研究内容
•     1.5.3 本课题的研究意义
• 第二章 产普鲁兰酶菌株的筛选与鉴定
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 污水来源
•     2.2.2 主要试剂
•     2.2.3 培养基
•     2.2.4 主要溶液配置
•     2.2.5 仪器设备
•     2.2.6 PCR引物
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 样品富集与菌种初筛
•     2.3.2 菌种复筛
•     2.3.3 普鲁兰酶活力的测定
•     2.3.4 产酶菌株的鉴定
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制
•     2.4.2 菌种筛选
•     2.4.3 菌种鉴定
•   2.5 本章小结
• 第三章 Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 菌株与质粒
•     3.2.2 主要试剂
•     3.2.3 培养基
•     3.2.4 主要溶液配置
•     3.2.5 仪器设备
•     3.2.6 引物设计
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 菌株活化与基因组的提取
•     3.3.2 普鲁兰酶基因的克隆
•     3.3.3 pulA基因的生物信息学分析
•     3.3.4 表达载体pET-28a（+）-pulA的构建
•     3.3.5 pET-28a（+）-pulA的诱导表达
•     3.3.6 重组普鲁兰酶的SDS-PAGE分析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 普鲁兰酶基因的克隆
•     3.4.2 普鲁兰酶生物信息学分析
•     3.4.3 普鲁兰酶的异源表达
•   3.5 本章小结
• 第四章 重组酶表达条件的优化与酶学性质分析
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验菌种
•     4.2.2 主要试剂与培养基
•     4.2.3 主要溶液配制
•     4.2.4 仪器设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 重组普鲁兰酶酶活力的测定
•     4.3.2 重组酶诱导条件优化
•     4.3.3 Ni柱亲和层析纯化重组普鲁兰酶
•     4.3.4 蛋白浓度的测定
•     4.3.5 重组酶的酶学性质研究
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 重组酶诱导条件优化
•     4.4.2 蛋白质标准曲线
•     4.4.3 重组普鲁兰酶的分离纯化
•     4.4.4 重组普鲁兰酶的酶学性质分析
•   4.5 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苏红玉

导师: 崔堂兵,李健雄

关键词: 普鲁兰酶,克隆表达,酶学性质

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华南理工大学

分类号: Q78

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.003302

总页数: 95

文件大小: 4248K

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