羽衣甘蓝天冬氨酸蛋白酶活性分析及与ARC1相互作用的研究

论文摘要

自交不亲和性（Self-incompatibility,SI）是雌雄可育同株植物自花授粉后不能产生种子。大多数十字花科植物表现出自交不亲和性,柱头识别和区分“自身”的花粉,从而防止自花授粉和近亲繁殖。目前,ARC1（Arm repeat containing 1）被认为是柱头乳突细胞内SI信号传递因子。ARC1具有E3泛素连接酶的活性,通过泛素/26S蛋白酶体途径将其下游底物降解,从而导致SI反应。为了进一步解析ARC1介导的SI反应机制,我们利用羽衣甘蓝CytoTrap酵母双杂交文库,筛选到ARC1相互作用蛋白天冬氨酸蛋白酶（Aspartic protease 1,ASP1）部分序列。在本文中,利用RACE方法获得ASP1全长cDNA;利用原核表达纯化技术获得ASP1重组蛋白,并进行了酶活性分析;利用免疫印迹检测ASP1在组织及柱头发育中的表达情况;最后,通过酵母双杂交分析ASP1与ARC1相互作用结构域。获得主要结果如下:1、利用RACE方法获得ASP1全长cDNA。BoASP1全长cDNA序列为1596 bp,包含69 bp的5’非编码区、144 bp的3’非编码区和一个长度为1383 bp的开放读码框（ORF）,对应编码一个含有460个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列比对分析表明,羽衣甘蓝BoASP1与油菜BnASP1、芜菁BrASP1的一致性分别为97%和93%。2、将BoASP1编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,获得pET-14b-BoASP1表达质粒。将表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中,利用IPTG进行诱导表达;SDS-PAGE结果显示在分子量51 kD处有蛋白特异性地诱导表达。利用NiP+-NTA树脂通过亲和层析的方法获得BoASP1蛋白。利用这个蛋白免疫小鼠,制备BoASP1多克隆抗体。3、分别提取了羽衣甘蓝萼片、花瓣、雄蕊、柱头、花柱、子房的总蛋白,利用免疫印迹技术检测BoASP1在组织中的的表达情况。结果发现BoASP1在组织中均有表达,而且在柱头、花柱萼片中表达较高。为了进一步分析BoASP1在柱头的表达水平,分别提取了柱头不同发育时期S1-S5的总蛋白。免疫印迹技术结果显示BoASP1在柱头发育各时期没有明显变化。4、为了分析ASP1酶活性,将BoASP1构建到原核表达载体pCold上,获得pCold-BoASP1质粒,并纯化可溶性蛋白BoASP1。利用FITC标记的酪蛋白作为底物进行BoASP1蛋白相对酶活性测定。酶活性分析显示BoASP1在0-300ng范围内蛋白水解活性逐渐增强,到300ng蛋白水解活性达到最高,300-500ng蛋白水解活性逐渐下降。5、为了分析两个活性位点DTG和DSG对ASP1蛋白水解酶活性的影响,将活性位点中的天冬氨酸突变为天冬酰胺,构建突变体pCold-BoASP1-M2质粒,并纯化可溶性蛋白BoASP1-M2。酶活性分析ASP1-M2在0-500ng范围内没有蛋白水解活性。这说明BoASP1蛋白水解酶活性依赖DTG和DSG活性位点。此外,利用天冬氨酸蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂A,能够抑制BoASP1的酶活性。这些结果说明BoASP1在体外具有天冬氨酸蛋白酶活性。6、为了分析BoASP 1与Bo ARC 1的相互作用结构域,构建pMyr-BoASP 1-4 0、pMyr-BoASP1 66-460、pMyr-BoASP1 190-460、pMyr-BoASP1280-460、pMyr-BoASP1 390-460 和pMyr-BoASP11-460-M2酵母表达载体。CytoTrap细胞质酵母双杂交系统结果显示BoASP1390-460 与 BoARC1 存在相互作用;而 BoASP16-460、BoASP1 190-460、BoASP1280-460、BoASP1-460、BoASP1-M2与BoARC1不具有相互作用。这些结果说明BoASP1390-460是与BoARC1相互作用的关键结构域。7、为了分析ARC 1与BoASP 1390-460相互作用结构域,构建pSos-BoARC1 1-271、pSos-BoARC1 1-361、pSos-BoARC1280-361、pSos-BoARC1 280-663、pSos-BoARC1362-66,pSos-BnARC1 1-280、pSos-BnARC1 1-359、pSos-BnARC1281-359、pSos-BnARC1281-661、pSos-BnARC1360-661和pSos-BnARC11-661载体。CytoTrap细胞质酵母双杂交结果显示BoARC1280-663 和 pSos-BnARC1281-661,即 U-box 结构域和 ARM 结构域与 BoASP1390-460存在相互作用;而 BoARC11-279、BoARC1-361、BoARC1280-361、BoARC1362-663与BoASP1390-460不存在相互作用。这些结果表明ARC1的C端介导了与ASP1的相互作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 植物天冬氨酸蛋白酶
•     1.1.1 植物天冬氨酸蛋白酶的结构与分类
•     1.1.2 植物天冬氨酸蛋白酶功能
•   1.2 芸苔属植物自交不亲和性研究进展
•     1.2.1 SCR/SP11
•     1.2.2 SRK
•     1.2.3 MLPK
•     1.2.4 ARC1
•     1.2.5 ARC1的下游传递因子
•   1.3 芸苔属植物的自交不亲和及其反应模型
•   1.4 本研究的目的意义
• 2 羽衣甘蓝BoASP1克隆及表达分析
•   2.1 材料
•     2.1.1 主要试验仪器
•     2.1.2 主要试验试剂
•     2.1.3 试验试剂配制
•   2.2 方法
•     2.2.1 BoASP1的5'RACE克隆
•     2.2.2 RT-PCR克隆BoASP1
•     2.2.3 原核表达载体的构建
•     2.2.4 BoASP1蛋白的原核表达及纯化
•     2.2.5 羽衣甘蓝植物组织蛋白提取
•     2.2.6 蛋白样品定量
•     2.2.7 免疫印迹法
•     2.2.8 BoASP1氨基酸序列比对分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 羽衣甘蓝ASP1基因的克隆及cDNA序列分析
•     2.3.2 BoASP1氨基酸多序列比对分析
•     2.3.3 BoASP1蛋白的结构域分析
•     2.3.4 BoASP1原核表达分析
•     2.3.5 免疫印迹分析BoASP1在花蕾中不同组织的表达量
•     2.3.6 免疫印迹分析BoASP1在柱头发育不同时期中表达情况
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 3 羽衣甘蓝BoASP1的体外酶活性分析
•   3.1 材料
•     3.1.1 主要实验试剂及仪器
•     3.1.2 主要实验试剂配置
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 BoASP1点突变的构建
•     3.2.2 克隆pCold-BoASP1和pCold-BoASP1-M2
•     3.2.3 BoASP1蛋白的原核表达及纯化
•     3.2.4 BoASP1的酶活性检测
•     3.2.5 胃蛋白酶抑制剂对BoASP酶活性的影响
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 原核表达克隆BoASP1
•     3.3.2 BoASP1蛋白质原核表达分析
•     3.3.3 BoASP1蛋白酶活性检测
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 4 酵母双杂交系统分析ASP1与ARC1相互作用
•   4.1 材料
•     4.1.1 基因亚克隆
•     4.1.2 酵母双杂交
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 酵母表达载体的构建
•     4.2.2 酵母双杂交
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 BoARC1与BoASP1结构域相互作用
• 390-460相互作用'>    4.3.2 BoARC1结构域与ASP1_390-460相互作用
• 390-460相互作用'>    4.3.3 BnARC1结构域与ASP1_390-460相互作用
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 硕士学位论文修改情况确认表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高杉

导师: 蓝兴国

关键词: 羽衣甘蓝,自交不亲和性,天冬氨酸蛋白酶,蛋白质相互作用

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 东北林业大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000589

总页数: 75

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