基于原子力显微镜的凝血因子Ⅷ界面取向研究

论文摘要

凝血因子Ⅷ（coagulation factor Ⅷ,FⅧ）作为凝血级联反应中的一种重要蛋白,其缺乏或功能障碍会导致严重的出血性疾病-血友病A（hemophilia A,HA）。FⅧ通过在细胞膜界面上与其它凝血因子组成蛋白复合物而发挥作用,其活性受到金属离子结合、生物膜接触的氨基酸种类、结合膜界面结构域的抗体、膜本身的物理化学性质等影响,提示FⅧ的功能可能与其在生物膜上的取向有关,但其中的分子调控机制还远不清楚。本学位论文主要基于原子力显微镜技术（Atomic Force Microscope,AFM）,通过单分子成像与力学性质测量,结合生物信息学分析方法,对FⅧ在界面的取向进行研究。在近生理环境中,利用AFM定量纳米力学成像（PeakForce Quantitative Nanomechanics,PF-QNM）模式,在单个蛋白水平上分析了不同浓度的钙离子对FⅧ的形貌和力学性质的影响。结果表明,钙离子具有影响FⅧ的重/轻链连接和结构柔性的双重作用:在缺乏钙离子时,FⅧ分子解离为轻链和重链;低浓度的钙离子（1.5 mM）不仅可以与轻链或/和重链结合,增大其刚度,而且可以部分将轻链和重链连接成完整的蛋白;在更高浓度钙离子存在（15 mM）时,钙离子除了将全部轻链和重链都连接成完整蛋白分子外,而且可以进一步增加整个蛋白分子的机械强度。这些结果为解释钙离子结合如何影响蛋白分子柔性进而改变蛋白功能活性提提供了新视角。在凝血过程中,FⅧ通过疏水性作用与膜结合是活化凝血级联反应的重要步骤。我们研究了亲/疏水性界面对蛋白取向的影响,发现FⅧ在疏水性界面的高度远高于其在亲水性界面的高度,而在疏水性界面的杨氏模量较小。生物信息学分析进一步揭示,C1和C2结构域在界面上具有更多的疏水性氨基酸。这些结果表明,弱静电力为蛋白与亲水性界面之间的主要作用力,引起FⅧ在界面的随机取向分布;而疏水性界面与FⅧ中C1和C2结构域之间强烈的疏水性作用力导致蛋白在HOPG界面的优先取向。在此基础上,我们进一步研究了凝血因子Ⅷ与生物膜的相互作用,直接观察到凝血因子FⅧ与带负电磷脂酰丝氨酸（PS）的特异性结合。生物信息学分析发现,C2区疏水性氨基酸的突变会导致蛋白插入疏水性孔洞的深度、倾斜角等的变化,进一步证实了疏水性氨基酸对蛋白在膜界面取向的影响。上述结果为研究FⅧ在细胞膜上的吸附和结合机制提供了新的思路,并将有助于抗凝血材料的设计。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
•   1.1 凝血反应
•   1.2 凝血因子Ⅷ （FⅧ）
•     1.2.1 分子结构
•     1.2.2 活化与失活
•     1.2.3 三维结构
•     1.2.4 金属离子
•     1.2.5 FⅧ与生物膜的相互作用
•   1.3 原子力显微镜（AFM）
•     1.3.1 成像原理
•     1.3.2 工作模式
•     1.3.3 在蛋白研究中的应用
•     1.3.4 蛋白与磷脂膜相互作用研究
•   1.4 关于本课题
•     1.4.1 课题的提出
•     1.4.2 研究目标
•     1.4.3 研究内容
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•   2.2 样品选取与制备
•     2.2.1 缓冲液的配制
•     2.2.2 凝血因子Ⅷ的配制
•     2.2.3 乳凝集素（lactadherin）的配制
•     2.2.4 磷脂膜制备
•   2.3 原子力显微镜
•     2.3.1 针尖清洗
•     2.3.2 轻敲模式成像
•     2.3.3 峰值力定量纳米力学成像（PeakForce Quantitative Nanomechanics,PF-QNM）
•   2.4 凝血因子Ⅷ三维结构分析
•   2.5 动态光散射（DLS）
•   2.6 凝血因子Ⅷ各结构域氨基酸亲疏水性分析
•     2.6.1 K-D 法测定 FⅧ 蛋白中氨基酸的亲疏水性
•     2.6.2 溶剂可及表面积（solvent accessible surface areas,ASA）
•   2.7 OPM （Orientations of proteins in membranes）分析
• 第3章 钙离子对凝血因子Ⅷ的影响
•   3.1 引言
•   3.2 结果与讨论
•   3.3 本章小结
• 第4章 凝血因子Ⅷ在疏水界面上的取向分析
•   4.1 引言
•   4.2 结果与讨论
•   4.3 本章小结
• 第5章 凝血因子Ⅷ与磷脂膜的相互作用研究
•   5.1 引言
•   5.2 结果与讨论
•     5.2.1 磷脂膜的选取与形态学表征
•     5.2.2 FⅧ与磷脂膜的相互作用
•   5.3 本章小结
• 第6章 膜界面氨基酸对凝血因子Ⅷ取向的影响
•   6.1 引言
•   6.2 结果与讨论
•   6.3 本章小结
• 第7章 总结与展望
•   7.1 研究结果总结
•   7.2 创新点
•   7.3 对后续工作的展望
•     7.3.1 利用原子力显微镜观察单个凝血蛋白与生物膜的作用过程..
•     7.3.2 利用原子力显微镜研究酶复合物与生物膜的作用过程
•   7.4 博士期间其它工作
•     7.4.1 绿脓杆菌群集感应分子诱导宿主免疫细胞凋亡
•     7.4.2 气体分子的生物学效应及与生物膜的相互作用
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 程洁

导师: 吕军鸿

关键词: 凝血因子,原子力显微镜,界面取向,力学性质,生物膜,生物信息学

来源: 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物医学工程

单位: 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)

分类号: R318

总页数: 114

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