DNA甲基转移酶N6AMT1基因敲降和过表达及其功能初探

论文摘要

DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在基因表达、细胞功能维持、胚胎发育以及肿瘤发生等方面发挥着重要作用。N6-甲基腺嘌呤（6mA）是DNA甲基化修饰方式之一,由甲基转移酶N6AMT1和去甲基化酶ALKBH1调控。研究发现,肿瘤组织中6mA及其甲基转移酶N6AMT1的水平呈现下调,而去甲基化酶ALKBH1的水平呈现上调。到目前为止,有关N6AMT1基因研究的报道甚少,对其具体生物学功能的研究十分匮乏。为进一步探究N6AMT1基因的功能,本研究首先鉴定了几个细胞系N6AMT1基因的表达水平,随后选择表达量较高的HEK293细胞系和表达量较低的Hela细胞系进行研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了 N6AMT1基因敲降的HEK293细胞系,同时构建了过表达N6AMT1基因的Hela细胞系。分析比较了 N6AMT1基因表达变化对细胞相关表型的影响,进而初步探讨了 N6AMT1基因的生物学功能。研究结果如下:1、不同细胞系的N6AMT1基因的表达水平测定。研究旨在检测不同类型细胞系中N6AMT1基因的表达水平,探究不同类型细胞N6AMT1基因的表达差异,主要是肿瘤细胞的表达差异。已有的细胞系分为两大类,一类是人的正常组织细胞系HEK293和L02,一类是肿瘤组织细胞系SMMC-7721、MCF7HepG2、BGC823、MDA-MB-231、MCF7、AGS、HCT116、KYSE-150 和 Hela。RT-qPCR 鉴定结果显示:正常肾上皮组织细胞系HEK293中N6AMT1基因的表达水显著高于癌细胞的表达水平;正常肝细胞系L02的N6AMT1基因的表达水平显著高于肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721。在上述测定的细胞系中,HEK293细胞的N6AMT1基因的表达水平最高,而Hela细胞的表达水平相对较低,因此选择HEK293细胞进行N6AMT1基因敲降,选用Hela细胞进行过表达研究。2、构建N6AMT1基因敲降的HEK293细胞系以及观察基因敲降对细胞表型的影响。在N6AMT1基因第一个外显子上设计sgRNA,构建N6AMT1-sgRNA载体,筛选出基因编辑效率最高的sgRNA表达载体。之后,开始构建同源重组载体,在编辑区上下游各选择40bp序列作为同源臂,将其连接在筛选标签基因和转录终止序列BGH ploy（A）的两端。本实验采用了两种组合的筛选基因,一种是含有PuroR和NeoR的双抗性基因组合;另一种是含有PuroR和eGFP的抗性基因和荧光基因的组合。前者利用嘌呤霉素（Puromycin）和新霉素（Neomycin）筛选转染细胞,后者用嘿呤霉素（Puromycin）并结合荧光表达情况筛选细胞。在CRISPR/Cas9系统介导的同源重组下,将Donor序列插入N6AMT1基因的第一个外显子中,利用插入标签基因的表达对HEK293细胞进行筛选。最后从DNA、RNA以及蛋白水平鉴定N6AMT1基因的敲降情况。结果表明:N6AMT1基因被成功编辑,N6AMT1基因RNA和蛋白水平均有显著降低,最终确认获得了 N6AMT1敲降的HEK293细胞系（命名为:HEK293-N6AMT1-Knowdown,HEK293-NK）。接着研究 N6AMT1 基因敲降对HEK293细胞表型的影响。分别在细胞周期、细胞增殖、细胞迁移以及细胞克隆形成这四个方面对HEK293-NK细胞进行检测。结果表明,N6AMT1基因敲降显著增强了HEK293细胞的增殖、迁移以及克隆形成能力。3、N6AMT1基因过表达对Hela细胞表型的影响。首先构建N6AMT1基因过表达载体pcDNA3.1-N6AMT1,再将过表达载体瞬时转染至Hela细胞中。RT-qPCR鉴定N6AMT1基因过表达后,对Hela细胞进行增殖实验和迁移实验。结果表明,Hela细胞过表达N6AMT1后,细胞的增殖和迁移均受到抑制。实验再次证明N6AMT1基因的确影响细胞的增殖和迁移能力。由此推测N6AMT1基因对肿瘤的发生和转移有一定的影响作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 文献综述
•   1 DNA甲基化
•     1.1 DNA甲基化
•     1.2 DNA甲基化修饰方式
•     1.3 DNA甲基化的检测方法
•   2 N6-甲基腺嘌吟修饰
•     2.1 DNA N6-甲基腺嘌呤修饰（6mA）
•     2.2 RNA N6-甲基腺嘌呤修饰（m6A）
•   3 DNA甲基转移酶与去甲基化酶
•     3.1 DNA甲基转移酶
•     3.2 DNA去甲基化酶
•     3.3 N6-腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶1（N6AMTI）
•   4 CRISPR/Cas系统
•     4.1 CRISPR/Cas系统简介
•     4.2 CRISPR/Cas系统的基本结构和作用机制
•     4.3 CRISPR/Cas9系统的基本原理和应用
•     4.4 CRISPR/Cas9技术存在的问题及其改进方法
•   5 研究的目的与意义
• 第二章 不同类型细胞系N6AMT1基因的表达水平
•   前言
•   1 实验材料
•     1.1 细胞系
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器
•     1.4 引物合成
•     1.5 试剂配制
•   2 实验方法
•     2.1 细胞培养
•     2.2 N6AMT1基因在不同细胞系中的RNA水平表达检测
•   3 结果分析
•   4 讨论
• 第三章 N6AMT1基因敲降对HEK293细胞表型的影响
•   前言
•   1 实验材料
•     1.1 细胞系和质粒
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器
•     1.4 试剂配制
•     1.5 合成相关引物
•   2 实验方法
•     2.1 N6AMT1基因敲降细胞系的建立
•     2.2 N6AMT1基因敲降对HEK293细胞表型的影响
•   3 结果与分析
•     3.1 成功建立N6AMT1基因敲降的细胞系
•     3.2 N6AMT1基因敲降对细胞表型的影响
•   4 讨论
• 第四章 N6AMT1基因过表达对Hela细胞表型的影响
•   前言
•   1 实验材料
•     1.1 细胞系和载体
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器
•   2 实验方法
•     2.1 构建过表达载体pcDNA3.1-N6AMT1
•     2.2 Hela细胞瞬时转染
•     2.3 N6AMT1基因过表达对Hela细胞表型的影响
•   3 实验结果
•     3.1 成功构建pcDNA3.1-N6AMT1过表达载体
•     3.2 N6AMT1基因过表达检测
•     3.3 过表达N6AMT1基因抑制Hela细胞增殖
•     3.4 过表达N6AMT1基因抑制Hela细胞迁移
•   4 讨论
• 全文总结
• 创新性
• 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨钰

导师: 崔恒宓

关键词: 甲基化,肿瘤

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 扬州大学

分类号: Q78

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001549

总页数: 61

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