论文摘要
禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是引发家禽肠外感染的重要病原菌,而APEC的致病力主要由其毒力基因的表达所决定。phoP/Q是禽致病性大肠杆菌中最重要的调控元件之一,能调控影响细菌的众多元件。鞭毛是大肠杆菌重要的运动和致病组件,Ⅲ型分泌系统（Type Three Secretion System,T3SS）是细菌鞭毛的核心与基础。motA和motB是跨膜蛋白,能够控制鞭毛的运动,影响细菌运动的方向和进退;cheA是与趋化受体的信号传导相关的组氨酸激酶,cheY是扩散性反应调节蛋白,可以被cheA磷酸化,能改变鞭毛的运动方向。motA/motB与cheA/cheY均靠近鞭毛且与鞭毛联系紧密,且是否参与phoP/Q调控鞭毛T3SS尚无相关文献报道。本课题旨在探究APEC中双组分系统phoP/Q与鞭毛Ⅲ型分泌系统（鞭毛T3SS）之间的联系。实验选取APEC的野生株AE17为研究对象,PCR统计鞭毛T3SS及其相关双组分基因分布情况,通过软件预测phoP/Q与鞭毛T3SS间的联系。于是将可能是中间调节子的四个基因motA、motB、cheA、chheY逐一敲除,并对基因缺失株展开生物学特性的研究。通过荧光定量PCR和β-半乳糖苷酶检测进一步验证motA/B、cheA/Y、phoP/Q与鞭毛T3SS三者间联系。具体研究内容和结果如下:1.禽致病性大肠杆菌双组分motA/B、cheA/Y生物学特性的评价以实验室临床分离并保存的的一株02血清型禽致病性大肠杆菌AE17为实验菌株。对其进行目的基因motA、motB、cheA,cheY的鉴定和缺失。结果鉴定,成功构建了四株相应的单基因缺失株（ΔmotA,ΔmotB,ΔcheA,AcheY）。此后,研究motA、motB、cheA、cheY基因对APEC生长特性、运动特性、生物被膜形成的影响。通过测定生长曲线发现,motA与cheA基因缺失加快了 AE17菌株的生长,而缺失cheY基因后,AE17菌株生长速度减慢;运动性实验结果表明,与原始株相比,ΔmotB的运动性降低,而ΔcheY的运动性能力显著增强;生物被膜实验结果显示,与原始株相比,四株缺失株生物被膜形成能力均降低但差异不显著（p<0.05）。2.禽致病性大肠杆菌motA/B、cheA/Y、phoP/Q和鞭毛T3SS基因分布及通路预测检测本实验保存的39株APEC临床分离株,鞭毛T3SS相关基因及双组分系统基因的分布情况。查阅相关文献并运用蛋白互作网络数据库string预测phoP/Q、鞭毛T3SS相关基因及基因座附近基因的关系。结果显示,28个鞭毛T3SS基因及其相关的7个双组份系统在不同的APEC血清型上均有较高的检出率。phoP/Q、鞭毛T3SS分别与鞭毛T3SS基因座附近的双组分系统motA/B、cheA/Y有密切联系,phoP/Q可能是通过鞭毛T3SS基因簇周围的双组份系统（motA/B、cheA/Y）间接调控鞭毛T3SS。3.禽致病性大肠杆菌motA/B、cheA/Y与phoP/Q调控鞭毛T3SS相关性分析分别检测原始株与缺失株中motA/B、cheA/Y、phoP/Q和28个鞭毛T3SS相关基因的转录水平进行检测。从结果可知,motA/B、cheA/Y、phoP/Q这三个双组分系统中只要有一个基因缺失,对其他双组份系统基因呈现至少一个以上基因转录水平差异显著（p<0.01）。此外,motA/B、cheA/Y、phoP/Q这三个双组份系统中任一基因缺失,都会导致28个鞭毛T3SS基因半数以上转录水平发生显著变化（p<0.01）。根据荧光定量PCR数据分析筛选,与启动子区域构建6个（pRCL-fhEAB、pRCL-cheY、pRCL-motBA、pRCL-fliD、pRCL-flgH、pRCL-phopq）β-半乳糖苷酶启动子重组质粒。将6个质粒分别导入到AE17菌株、ΔphoP、ΔphoQ、ΔmotA、ΔmotB、ΔcheA和ΔcheY缺失株中,并进行β-半乳糖苷酶活性检测。结果表明,motA、motB、cheY蛋白对phoP/phoQ基因的转录启动有正反馈调节作用,phoQ、cheA、cheY蛋白对motA/motB基因的转录启动有明显的正反馈调节作用。phoP、phoQ、cheA蛋白对fliD基因的转录启动有明显的负反馈调节作用,cheY蛋白对fliD基因的转录启动有明显的正反馈调节作用;phoP、phoQ、cheA蛋白对flhE/flhB/flhA基因的转录启动有明显的正反馈调节作用,motB蛋白对flhE/flhB/flhA基因的转录启动有明显的负反馈调节作用。通过以上实验成功构建motA、motB、cheA、cheY单基因缺失株,这四个基因均能影响细菌的生长与运动;wotA/B、phoP/Q、cheY/A与鞭毛T3SS基因在APEC中具有较高检出率与保守性;motA/B、cheY/A、phoP/Q双组份系统均能调控大多数鞭毛T3SS基因,且三对双组份系统之间存在互相调控;此外,通过软件分析和实验验证phoP/Q可能是通过调控motA/B、cheY/A间接调控鞭毛T3SS。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 邓志文
导师: 祁克宗
关键词: 禽致病性大肠杆菌,鞭毛
来源: 安徽农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 安徽农业大学
分类号: S852.61
DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000463
总页数: 68
文件大小: 6219K
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标签：禽致病性大肠杆菌论文; 鞭毛论文;