军团菌FEZ-1酶与头孢菌素类抗生素的结合过程研究

论文摘要

超级细菌耐药机制之一就是产生金属β-内酰胺酶（Metallo-beta lactamase,MβL）来水解抗生素。来自军团菌的FEZ-1酶是MβL中B3亚群的一员,双锌,能水解多种抗生素,其中,对头孢类抗生素的水解活性最强,基于此,本课题选择FEZ-1酶与头孢菌素类抗生素头孢噻吩（Cephalothin,CEF）、头孢噻啶（Cephaloridine,LOR）和头孢他啶（Ceftazidime,CAZ）作为研究对象,采用荧光光谱、分子对接和分子动力学模拟等方法来研究它们在结合过程中FEZ-1酶分子构象的变化以及抗生素分子的空间分布取向等,同时分析抗生素不同侧链对FEZ-1酶结合能力的影响,以期对未来设计更耐水解的抗生素提供参考。本课题主要包括以下四个方面的研究:（1）以基因重组的方法克隆表达了FEZ-1酶,并通过透析法分离纯化,得到纯度较高的FEZ-1酶。经测定,蛋白浓度为6.0×10-66 mol/L。（2）以荧光猝灭光谱、同步荧光光谱及三维荧光光谱的方法研究了FEZ-1酶与三种头孢类抗生素分子之间的相互作用以及结合过程中FEZ-1酶分子构象的变化。结果表明,三种抗生素与FEZ-1酶的复合物体系均发生明显的荧光猝灭,说明三种头孢类抗生素均能与FEZ-1酶发生相互作用,猝灭类型均为静态猝灭;三种复合物体系中,最大发射峰位置发生不同程度的红移,CEF>LOR>CAZ,表明FEZ-1酶分子的微环境均发生变化,亲水性增加,进而表明FEZ-1酶的构象发生变化。（3）以分子对接和动力学模拟的方法研究了FEZ-1酶与抗生素分子结合过程中FEZ-1酶分子构象的变化。分子对接结果表明,在三个体系中,CEF与FEZ-1酶结合最好,结合能量最低,CAZ难以与FEZ-1形成正确的配位键,结合最弱。动力学模拟结果表明,CEF与FEZ-1体系构象变化最有利于二者结合,LOR与FEZ-1体系次之,而CAZ与FEZ-1几乎不能以合理的方式结合。同时结合模式图结果显示,位于活性口袋处的CAZ分子母环发生明显偏转,羧基氧原子绕到活性口袋外侧,使其不能与FEZ-1酶很好结合,表明CAZ与FEZ-1的结合最不稳定。（4）结合自由能结果表明,CEF和LOR与FEZ-1酶的结合自由能较低,而CAZ与FEZ-1酶结合自由能较高,三个体系均是静电作用力与极性溶剂化能作为主要驱动力;结合自由能分解结果表明,Zn264对体系总的结合自由能贡献最大,且主要通过静电力的形式存在。以上构象变化和能量分析结果均表明,CAZ更难与FEZ-1酶稳定结合,这可能由于CAZ侧链结构较为复杂,进而在酶分子的活性口袋内形成较大的空间位阻,且侧链削弱了抗生素母环上的羧基氧原子与Zn264之间的亲和力,导致酶与抗生素较难稳定结合。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语对照表
• 第一章 绪论
•   1.1 前言
•   1.2 抗生素抗菌机制
•   1.3 超级细菌耐药机制
•   1.4 金属β-内酰胺酶
•   1.5 头孢菌素类抗生素
•   1.6 研究方法
•     1.6.1 荧光光谱法
•     1.6.2 分子对接
•     1.6.3 动力学模拟
•   1.7 研究内容及意义
•     1.7.1 研究内容
•     1.7.2 研究意义
• 第二章 FEZ-1 酶的表达鉴定与分离纯化
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 工程菌
•     2.2.2 试剂
•     2.2.3 实验仪器及型号
•     2.2.4 配制实验溶液
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 FEZ-1 酶的诱导表达
•     2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的表达
•     2.3.3 FEZ-1 酶的浓度测定
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 FEZ-1 酶的表达和纯化分析
•   2.5 本章小结
• 第三章 FEZ-1 酶与头孢菌素类抗生素的荧光光谱研究
•   3.1 引言
•   3.2 仪器及试剂
•     3.2.1 仪器
•     3.2.2 试剂
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 荧光猝灭光谱测定
•     3.3.2 同步荧光光谱测定
•     3.3.3 三维荧光光谱测定
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 FEZ-1 酶与三种抗生素的荧光猝灭光谱的结果分析
•     3.4.2 FEZ-1 酶与三种抗生素的同步荧光光谱的结果分析
•     3.4.3 FEZ-1 酶与三种抗生素的三维荧光光谱的结果分析
•   3.5 本章小结
• 第四章 FEZ-1 酶与头孢菌素类抗生素结合过程的动力学模拟研究
•   4.1 引言
•   4.2 FEZ-1 酶与CEF结合过程的动力学研究过程
•     4.2.1 FEZ-1 酶与CEF的分子对接
•     4.2.2 FEZ-1 酶与CEF复合物的动力学模拟
•   4.3 FEZ-1 酶与LOR结合过程中的动力学模拟研究过程
•     4.3.1 FEZ-1 酶与LOR复合物的分子对接
•     4.3.2 FEZ-1 酶与LOR复合物的动力学模拟
•   4.4 FEZ-1 酶与CAZ结合过程的动力学模拟研究过程
•     4.4.1 FEZ-1 酶与CAZ复合物的分子对接
•     4.4.2 FEZ-1 酶与CAZ复合物的动力学模拟
•   4.5 实验结果与分析
•     4.5.1 FEZ-1 酶和CEF的分子对接与动力学模拟结果分析
•     4.5.2 FEZ-1 酶和LOR的分子对接与动力学模拟结果分析
•     4.5.3 FEZ-1 酶和CAZ的分子对接与动力学模拟结果分析
•   4.6 本章小结
• 第五章 FEZ-1 酶与头孢菌素类抗生素分子的结合自由能分析
•   5.1 引言
•   5.2 结合自由能计算
•     5.2.1 FEZ-1 酶与CEF的结合自由能计算
•     5.2.2 FEZ-1 酶与LOR的结合自由能计算
•     5.2.3 FEZ-1 酶与CAZ的结合自由能计算
•   5.3 结合自由能分解计算
•     5.3.1 FEZ-1 酶与CEF的结合自由能分解计算
•     5.3.2 FEZ-1 酶与LOR的结合自由能分解计算
•     5.3.3 FEZ-1 酶与CAZ的结合自由能分解计算
•   5.4 本章小结
• 总结与讨论
• 参考文献
• 攻读博士/硕士学位期间取得的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李玉华

导师: 边六交

关键词: 抗生素,荧光光谱,分子对接,动力学模拟

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,药学

单位: 西北大学

基金: 陕西省科技统筹创新工程计划项目(2016KTCQ02-18)

分类号: R978.1;Q78

总页数: 78

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