枯草芽孢杆菌降解纤维素的作用及纤维素酶基因过表达载体的构建

论文摘要

纤维素是一种天然高聚体多糖物质,天然环境中的含纤维素的物质仅有很少一部分得到分解利用。微生物所产的纤维素酶在通常条件下便可以降解纤维素,因而微生物处理是纤维素利用研究的一大热点。但是,不同种类微生物特点各异,综合降解能力往往偏低,且降解机制与过程的研究尚有很多不清楚的地方,因而目前尚难以提升微生物在降解纤维素中的利用价值。蛋氨酸、赖氨酸和亮氨酸这三种氨基酸在动植物蛋白中普遍含量不高,却在畜牧业中具有重要的作用。在畜牧饲料应用中,这三种氨基酸的需求量很大,但工业合成这三种氨基酸不仅成本高,而且还有产物分子结构手性的问题,不适合将其直接添加使用。益生菌是一类可以有效改善动物机体内微生物菌群组成,在互利共生的代谢过程中可以产生有利于寄主的物质或作用的一大类微生物。枯草芽孢杆菌是益生菌的一种,其益生作用在国内外相关的文献报道很多,不仅被我国农业部列入安全饲料微生物添加剂名单之中,也被美国FDA认定为可安全用于食品与医药的微生物之一。在畜牧饲料中添加枯草芽孢杆菌,能够显著提升饲养畜禽的免疫力,改善菌群平衡与机体消化能力,提高饲料的吸收率,进而提升畜禽品质。而且枯草芽孢杆菌也是一种优秀的产酶微生物,能够分泌包括纤维素酶在内的各类降解酶。本研究首先从益生菌制品中分离纯化得到了一株枯草芽孢杆菌,并使用PCR法进行了鉴定。研究分析了分离出的枯草芽孢杆菌对含纤维素类物质的降解作用,包括其降解纤维素、半纤维素和木质素能力的检测,相应的酶活力的检测,总蛋白的变化及Met、Lys和Leu的含量变化检测。然后利用基因工程方法,获取了枯草芽孢杆菌内切-β-1,4-葡聚糖苷酶基因（endo-beta-1,4-glucanase,CE）。将此基因与表达载体pHT43酶切重组,构建了pHT43-CE内源过表达载体。之后,使用自然感受态法制作载体菌感受态,成功构建过表达载体后设计了试验验证了目的基因在目的菌中的表达。最后检测了枯草芽孢杆菌重组菌降解纤维素能力的提升情况以及纤维素酶活力的提升情况。试验结果表明,枯草芽孢杆菌在试验中表现出较明显的降解纤维素的效果,不具有降解半纤维素和木质素的效果;发酵产物的总蛋白质含量相对于未添加富含纤维素试验样品底物的对照组相比提升了9.4%;发酵产物中的Met、Lys和Leu含量分别提升了31.4%、42.2%和4.9%。分析表明,枯草芽孢杆菌利用纤维素底物合成更多的蛋白质和限制性必需氨基酸。对转入pHT43-CE的枯草芽胞杆菌进行了验证,试验结果表明成功将pHT43-CE转入枯草芽孢杆菌中,成功构建了转纤维素酶基因枯草芽孢杆菌工程菌。重组菌经IPTG诱导后,与未转化枯草芽孢杆菌及未经IPTG诱导的转化菌相比,目的基因的mRNA和蛋白表达水平有显著提升。对转入pHT43-CE的重组菌降解纤维素能力进行了检测,与未转化枯草芽孢杆菌及未经IPTG诱导的转化菌相比,经IPTG诱导的重组菌的降解能力有显著提升。本研究结果为该重组菌作为饲料添加剂的进一步应用提供了理论和技术基础。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
•   1.1 纤维素的概述及其应用
•     1.1.1 纤维素的概述
•     1.1.2 纤维素在畜牧业中的利用及优势
•   1.2 纤维素酶的概述及研究进展
•   1.3 蛋氨酸、赖氨酸与亮氨酸的物化性质及其在畜牧产业中的研究与已得到的应用
•     1.3.1 蛋氨酸、赖氨酸与亮氨酸的简介
•     1.3.2 蛋氨酸、赖氨酸与亮氨酸在畜牧饲料上的研究应用
•   1.4 益生菌的概述及应用
•     1.4.1 益生菌的概念与分类
•     1.4.2 益生菌的作用及其在畜牧上的应用
•   1.5 枯草芽孢杆菌的概述及在畜牧业上的应用
•     1.5.1 枯草芽孢杆菌的背景资料介绍
•     1.5.2 枯草芽孢杆菌在畜牧业中的应用
•   1.6 转基因枯草芽孢杆菌的研究进展
•   1.7 试验目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 试验载体菌种
•     2.1.2 常用培养基
•     2.1.3 主要试验药品
•     2.1.4 主要试验仪器
•     2.1.5 主要试剂和缓冲液的配制
•     2.1.6 引物设计
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 益生菌样品的菌种的分离纯化与鉴定
•     2.2.2 枯草芽孢杆菌发酵牧草样品中纤维素、半纤维素和木质素降解能力的检测
•     2.2.3 枯草芽孢杆菌发酵牧草样品中纤维素、半纤维素和木质素酶活力的检测
•     2.2.4 添加牧草样品与未添加样品发酵后发酵液总蛋白含量的检测
•     2.2.5 培养基发酵后发酵液中Met、Lys和 Leu含量的检测
•     2.2.6 纤维素酶基因的获取
•     2.2.7 枯草芽孢杆菌表达载体的构建、转化及阳性重组子鉴定
•     2.2.8 重组质粒在枯草芽孢杆菌中目的基因mRNA水平的表达
•     2.2.9 重组质粒在枯草芽孢杆菌中目的基因蛋白水平的表达
•     2.2.10 重组枯草芽孢杆菌及野生菌株传代稳定性和生长曲线的测定
• 3 结果与分析
•   3.1 枯草芽孢杆菌菌种的分离纯化与鉴定
•     3.1.1 益生菌菌种的分离、纯化与初步鉴定
•     3.1.2 PCR特异引物扩增法对已获取益生菌菌种的种属鉴定
•   3.2 枯草芽孢杆菌降解纤维素作用的分析
•     3.2.1 枯草芽孢杆菌对纤维素、半纤维素和木质素的降解能力的检测
•     3.2.2 枯草芽孢杆菌降解纤维素、半纤维素和木质素的酶活力的检测
•     3.2.3 添加牧草样品与未添加样品发酵后发酵液总蛋白含量的比较
•     3.2.4 添加牧草样品与未添加样品发酵后发酵液中Met、Lys和 Leu含量的比较
•   3.3 纤维素酶基因的获取
•   3.4 枯草芽孢杆菌中重组表达载体构建与鉴定
•     3.4.1 重组质粒pHT43-CE的构建
•     3.4.2 重组质粒pHT43-CE的验证
•   3.5 枯草芽孢杆菌重组载体的转化及基因表达能力的检测
•     3.5.1 枯草芽孢杆菌重组质粒的转化与鉴定
•     3.5.2 枯草芽孢杆菌重组载体mRNA水平的表达检测
•     3.5.3 枯草芽孢杆菌重组载体蛋白水平的表达检测
•   3.6 枯草芽孢杆菌重组质粒的稳定性检测
•     3.6.1 枯草芽孢杆菌重组菌与野生菌株的生长曲线的检测与比较
•     3.6.2 枯草芽孢杆菌重组菌的传代稳定性检测
•   3.7 重组枯草芽孢杆菌降纤维素解能力提升情况的检测
•     3.7.1 重组枯草芽孢杆菌的纤维素降解能力提升情况
•     3.7.2 枯草芽孢杆菌重组菌的纤维素酶活力的检测
• 4 讨论
•   4.1 益生菌的PCR菌种鉴定
•   4.2 枯草芽孢杆菌降解纤维素作用的分析
•   4.3 纤维素酶基因的获取
•   4.4 重组表达载体的构建
•   4.5 重组载体在枯草芽孢杆菌中的表达情况
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 温学鹏

导师: 高学军

关键词: 纤维素降解,限制性必需氨基酸,枯草芽孢杆菌,原核表达,内切,葡聚糖苷酶

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 东北农业大学

分类号: Q78;S816.3

总页数: 61

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