睾丸酮丛毛单胞菌中KAR的生物学功能及调控研究

论文摘要

睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)是一种能够降解甾体类激素的革兰氏阴性细菌,因其在环境修复中有重要的生物学作用,国内外专家学者对其在菌体细胞与环境、菌体内代谢酶、菌体基因之间相互作用等进行了广泛研究。本文以睾丸酮丛毛单胞菌中短链脱氢酶KAR为研究对象,通过敲除菌株构建、甾体类激素诱导、高效液相色谱分析、质粒共转化等方法研究KAR基因对五种甾体类激素的降解作用,同时研究了睾丸酮丛毛单胞菌中三种调控蛋白对KAR的生物学调控作用。实验结果表明:通过HPLC检测野生型和KAR敲除突变的睾丸酮丛毛单胞菌激素降解情况,激素分别诱导14小时后,各种激素的残留量呈现出明显的差距。其中突变菌株中睾丸酮残留量要高于野生型43%左右;雌酮残留量要高于野生型37%左右;孕酮雌酮残留量要高于野生型28%左右,而雌二醇和甲睾酮分别相差9%和8%。睾丸酮丛毛单胞菌KAR基因敲除以后其降解甾体类激素的能力受到了影响,影响程度上睾丸酮>雌酮>孕酮>雌二醇>甲睾酮。通过将含有三种调控蛋白的重组质粒与含启动子的KAR重组质粒共转化到BL21菌株中,激素诱导后,ELSA检测结果为,LuxR与KAR的共转化菌中,KAR表达量明显上升;LysR与KAR的共转化菌中,KAR表达量下降;TetR与KAR的共转化菌中,KAR表达量无明显变化。本文实验结果对于进一步研究KAR酶在睾丸酮丛毛单胞菌中甾体类激素代谢作用及调控研究提供实验基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 国内外研究现状
•   1.3 研究目的与意义
•   1.4 研究方案
• 第二章 KAR的基因克隆及表达载体构建
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株及质粒
•     2.1.2 仪器与药品
•     2.1.3 试剂及溶液
•   2.2 实验内容
•     2.2.1 睾丸酮丛毛单胞菌ATCC11996总DNA的提取
•     2.2.2 引物设计及合成
•     2.2.3 目的基因的克隆
•     2.2.4 重组质粒p MD18-T-KAR的构建
•     2.2.5 质粒鉴定
•     2.2.6 表达载体的构建
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 目的基因的获取
•     2.3.2 重组质粒p MD18-T-KAR载体鉴定
•     2.3.3 表达载体p ET15b-KAR的构建及鉴定
•   2.4 本章小结
• 第三章 KAR的表达及纯化
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 仪器与药品
•     3.1.2 试剂及培养基
•   3.2 实验内容
•     3.2.1 重组质粒p ET-15b-KAR转化入大肠杆菌BL21（DE3）
•     3.2.2 筛选阳性克隆子
•     3.2.3 诱导表达重组载体pET-15b-KAR
•     3.2.4 KAR蛋白的分离纯化
•     3.2.5 KAR蛋白含量测定
•   3.3 试验结果
•     3.3.1 BL21（DE3）中重组载体p ET-15b-KAR的筛选
•     3.3.2 重组表达载体p ET-15b-KAR的诱导表达
•     3.3.3 目的蛋白的纯化
•     3.3.4 纯化后的KAR可溶性蛋白浓度测定
•   3.4 本章小结
• 第四章 KAR多克隆抗体制备及效价测定
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 试剂及仪器
•     4.1.2 实验动物
•     4.1.3 溶液及培养基
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 制备KAR多克隆抗体
•     4.2.2 抗体效价的测定
•     4.2.3 KAR的 ELISA标准曲线建立
•     4.2.4 睾丸酮丛毛单胞菌中KAR在甾体激素诱导下的ELSIA测定
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 测定小鼠血清效价
•     4.3.2 ELISA标准曲线的建立
•     4.3.3 睾丸酮丛毛单胞菌中KAR在甾体激素诱导下的ELSIA测定
•   4.4 本章小结
• 第五章 构建KDR敲除菌株及生理活性研究
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 菌株来源
•     5.1.2 试剂和仪器
•     5.1.3 培养基及试剂配置
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 克隆KAR基因片段
•     5.2.2 pCR2.1-TOPO-MKAR载体构建
•     5.2.3 KAR变异菌株的筛选及鉴定
•     5.2.4 KAR降解激素的功能表征
•   5.3 实验结果
•     5.3.1 目的基因的获取
•     5.3.2 pMD18-T-MKAR载体质粒构建及鉴定
•     5.3.3 pCR2.1-TOPO-MKAR电转化质粒的构建
•     5.3.4 KAR变异菌株的PCR筛选及鉴定
•     5.3.5 HPLC检测培养基中的类固醇激素残留量
•   5.4 本章小结
• 第六章 Tet R、LysR、Lux R蛋白基因与KAR的调控研究
•   6.1 实验材料
•     6.1.1 质粒及菌株
•     6.1.2 仪器与药品
•   6.2 实验内容
•     6.2.1 目的基因的获取
•     6.2.2 pMD18-T-215KAR重组质粒的构建
•     6.2.3 pK18-215KAR重组质粒的构建及鉴定
•     6.2.4 pUC19-LysR/LuxR/TetR重组质粒鉴定
•     6.2.5 pK18-215KAR分别与pUC19-LysR/LuxR/TetR质粒进行共转化
•     6.2.6 共转化菌株的诱导表达及总蛋白的提取
•     6.2.7 间接法ELISA检测共转化菌株总蛋白中KAR脱氢酶含量
•   6.3 结果
•     6.3.1 目的基因的获取
•     6.3.2 pMD18-T-215KAR重组载体的构建及鉴定
•     6.3.3 pK18-215KAR重组质粒的构建及鉴定
•     6.3.4 pUC19-LysR/LuxR/TetR重组质粒鉴定
•     6.3.5 质粒共转化及ELISA方法鉴定
•   6.4 本章小结
• 第七章 结论与展望
•   7.1 结论
•   7.2 展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李泽琦

导师: 于源华

关键词: 睾丸酮丛毛单胞菌,基因调控,甾体类激素

来源: 长春理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 长春理工大学

分类号: Q935

总页数: 81

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