猪传染性胃肠炎病毒在低血清培养基驯化的PK-15细胞中增殖规律观察

论文摘要

猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）是一种高度接触性传播的急性肠道病毒,两周龄内仔猪感染伴有严重腹泻,脱水,呕吐等症状,死亡率极高。该病暂无特异性药物或有效的治疗方法,其防控主要以注射疫苗为主。目前大部分相关疫苗生产厂家采用PK-15细胞增殖TGEV来制造TGEV疫苗。牛血清作为PK-15细胞增殖培养中的重要营养物质来源,通常用量达到培养基的10%左右,但牛血清价格昂贵,且每批次血清会随着提供的血清牛的个体差异变化而变化,从而影响细胞的生长,而不同品质的血清培养的细胞质量差异较大;其次,血清的成分复杂,含细胞毒性物质及抑制成分也会影响细胞的生长;牛血清中携带血源性细菌、支原体等病原生物增加了污染细胞的风险。本研究从血清市场及疫苗制造的实际情况出发,经过低血清培养基驯化培养PK-15细胞,以常规培养基组（10%FBS）为对照组,低血清培养基组（2%FBS）为试验组,分别选用两种不同培养基增殖培养TGEV,观察计算病毒TCID50,建立TGEV qRT-PCR检测方法测定不同培养基中细胞内外病毒增殖含量。结果显示,低血清培养基中TGEV的病毒效价并未受到影响,感染组24h后细胞内、48 h后细胞外病毒含量有所提升且明显高于对照组,表明本试验所驯化的PK-15细胞可用于TGEV的增殖。应用流式细胞仪检测两种培养基中TGEV感染PK-15细胞前后凋亡率,结果显示,低血清培养体系中虽然血清浓度降低,但其存在的代替血清功效的物质同血清一样具有延缓细胞凋亡的作用,不会因为血清含量降低而加快诱导细胞凋亡;TGEV感染PK-15细胞后,凋亡率均随时间增长逐渐上升,表明两种培养基中TGEV都能够显著诱导PK-15细胞发生凋亡,但在72 h两组数据差异显著,证明低血清培养基对TGEV诱导PK-15细胞产生凋亡有一定的影响,具体如何影响还有待进一步研究;通过建立的细胞凋亡相关基因Bcl-xL、Mcl-1及Puma qRT-PCR检测方法对两种培养基中TGEV感染PK-15细胞前后Bcl-xL、Mcl-1及Puma mRNA转录水平进行检测,证实了低血清培养基对细胞凋亡基因的转录有一定的影响,从而影响细胞凋亡的发生,然而究竟是以何种方式对其进行调控的,还有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要缩略词
• 第一章 文献综述
•   1 细胞培养技术
•     1.1 细胞培养技术的发展
•     1.2 低血清培养基研究进展
•     1.3 PK-15 细胞特征及应用研究
•   2 TGEV及其疫苗研究现状
•     2.1 TGEV研究现状
•     2.2 TGEV疫苗研究进展
•   3 细胞凋亡
•     3.1 细胞凋亡概述
•     3.2 细胞凋亡的诱导因素
•     3.3 TGEV诱导细胞凋亡研究进展
•   4 研究目的及意义
• 第二章 低血清培养基驯化PK-15 细胞及其对TGEV增殖的影响
•   1 试验材料
•     1.1 细胞、毒株
•     1.2 主要试剂及配制方法
•     1.3 主要仪器
•   2 试验方法
•     2.1 细胞复苏与传代
•     2.2 PK-15 低血清培养基驯化
•     2.3 PK-15 细胞计数绘制生长曲线及48 h倍增比图
•     2.4 低血清培养基（2%FBS）驯化的PK-15 细胞的冻存及复苏
•     2.5 两种培养基中TGEV的增殖特性观察
•     2.6 两种培养基中TGEV TCID50 的测定
•     2.7 TGEV qRT-PCR方法的建立
•     2.8 TGEV在两种培养基培养的PK-15 细胞中一步生长曲线绘制
•   3 结果
•     3.1 常规培养基（10%FBS）复苏的PK-15 细胞
•     3.2 混合培养基培养的PK-15 细胞
•     3.3 低血清培养基不同血清浓度驯化培养PK-15 细胞
•     3.4 两种培养基不同血清浓度驯化的PK-15 细胞生长曲线及48 h倍增比
•     3.5 低血清培养基（2%FBS）培养的PK-15 细胞冻存及复苏结果
•     3.6 两种培养基不同时间点细胞病变结果
•     3.7 TGEV TCID50 测定结果
•     3.8 TGEV qRT-PCR检测方法的建立
•     3.9 TGEV在两种培养基培养的PK-15 细胞中的一步生长曲线
•   4 讨论
•   5 小结
• 第三章 低血清培养基对TGEV诱导PK-15 细胞凋亡的影响
•   1 试验材料
•     1.1 细胞、毒株
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器
•   2 试验方法
•     2.1 流式细胞仪对两种培养基中感染TGEV的 PK-15 细胞凋亡率的检测
•     2.2 细胞凋亡相关基因Bcl-xL、Mcl-1及Puma qRT-PCR方法的建立
•     2.3 细胞凋亡相关基因m RNA转录水平的测定
•   3 结果
•     3.1 流式细胞仪对两种培养基中TGEV感染PK-15 细胞凋亡率的检测
•     3.2 细胞凋亡基因方法的建立
•     3.3 两种培养基中TGEV感染PK-15 细胞前后Bcl-xL、Mcl-1及Puma mRNA转录水平的变化
•   4 讨论
•   5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介及发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 龚双燕

导师: 徐志文,周明忠

关键词: 低血清培养基,细胞,细胞凋亡

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000384

总页数: 63

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