导读:本文包含了活细胞荧光成像论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:MicroRNA,核酸扩增策略,生物传感,活细胞成像
活细胞荧光成像论文文献综述
王瑞[1]（2019）在《癌症相关microRNA的荧光生物传感及活细胞成像方法研究》一文中研究指出MicroRNAs(miRNAs)是一类存在于真核细胞内的非编码RNA分子,由18~24个核苷酸组成。miRNAs通过降解目标mRNA或抑制其转录后翻译调控基因表达。miRNAs可以调控多种生物过程,例如早期发育、免疫反应、造血、细胞增殖、分化和凋亡等。此外,越来越多的研究表明,miRNAs的异常表达与癌症的发生和发展密切相关,已被用作重要的癌症诊断标志物和治疗靶点。因此,miRNAs的特异和灵敏检测对于癌症的诊断和治疗具有重要意义。miRNA具有一些特有性质,例如尺寸短、表达水平低、同源之间序列相似、易被酶降解等。针对这些特性,研究者构建了一些基于核酸扩增策略的miRNA检测方法。虽然这些方法在一定程度上提高了 miRNA检测的灵敏度和特异性,然而miRNA的检测仍然存在一些不足和挑战:1)现有的miRNA识别模式只能在有限的功能区域内发挥识别作用,不能完全区别碱基错配位置分布在各种区域的同源性miRNA;2)蛋白酶介导的信号扩增策略用于细胞内miRNA的检测时,蛋白酶的入胞需要将细胞固定化,容易造成细胞受损或死亡,无法满足活细胞中miRNA检测的需要;3)目前miRNA的检测多为单重检测,miRNA的多重检测对于癌症的准确诊断和治疗更具有指导意义;4)如何以miRNA作为逻辑输入构建逻辑平台实现癌症风险评估和不同表型癌细胞的鉴别?本论文针对已有的不足和挑战,设计了四种实验方案用于miRNA的生物传感检测和活细胞成像研究。本文分为以下六章:第一章为绪论部分,主要概述了 miRNA的特征、作用机理、生物学意义和已有的检测方法,并总结了已有检测方法存在的不足。第二章,构建了一种分裂式识别模式结合级联信号扩增策略用于miRNA的高特异和灵敏检测。设计两种识别探针,包括具有粘性末端的发夹探针(HP)和辅助探针(AP)。首先,HP的粘性末端和AP同时识别miRNA的一部分,HP通过粘性末端介导的链置换反应打开,形成稳定的DNAY型结构。接下来,DNA Y型结构中的AP可以进一步作为引物触发链置换扩增(SDA)反应,产生大量的trigger序列。最后,trigger序列与设计为具有G四倍体互补序列和Nt.BbvCI内切酶切刻位点的锁式DNA杂交,启动循环滚环扩增(RCA)反应,产生大量G四倍体序列。G四倍体序列能够结合N-甲基-卟啉IX(NMM),生成用于miRNA检测的增强的荧光信号。本策略中,miRNA的识别序列被分裂在两种不同的识别探针中。无论碱基错配位点位于何种位置,粘性末端介导的链置换反应的速率变化和直接杂交反应热力学能量变化的协同作用,使得DNA Y型结构无法稳定形成。该识别模式的双重识别效应保证了本策略良好的特异性。由于级联信号扩增反应高的扩增效率,本策略能够灵敏检测let-7b,检测限为3.2 pM。而且,本策略还对HeLa细胞裂解液中let-7b的含量进行了测定。这些实验结果表明,本工作为临床诊断和疾病治疗中miRNA的检测提供了一种有潜力的策略。第叁章,基于DNAzyme驱动的叁维DNA walker和杂交链式反应(HCR)级联信号扩增,构建了一种无酶免标记的荧光生物传感器用于miRNA的检测。首先walking probe与 locking DNA杂交,使walking probe 中的DNAzyme功能区域被封住,形成被锁住的walking probe(BWPs)。然后,将BWPs和发夹DNA底物(HDSs)修饰在磁球的表面。当miRNA存在时,miRNA与locking DNA杂交,使得locking DNA通过粘性末端介导的链置换的方式从BWPs上释放下来,暴露出DNAzyme的功能区域。然后,walking probe沿着叁维的轨道运动,切割HDSs,产生大量的触发链。最后,触发链启动随后的HCR过程,产生大量完整的G四倍体序列。G四倍体序列能够结合NMM,产生用于miRNA检测的增强的荧光信号。与蛋白酶驱动的叁维DNA walker相比,DNAzyme驱动的DNA walker更加简单和稳定。所有的DNA组件都修饰在同一个磁球上,大大增加了探针的局部浓度和反应效率。而且,磁球可以通过外加磁场分离出去,保证了较低的背景信号。叁维DNA walker和HCR级联信号放大反应的高扩增效率确保了木策略良好的灵敏度,检测限为7.9 fM。而且,本策略还对HeLa细胞裂解液中let-7a的含量进行了测定。以上结果表明本工作为miRNA的定量检测提供了一种有潜力的策略。第四章,构建了一种pH响应型ZnO纳米探针介导的DNAzyme信号扩增策略用于多重miRNAs的灵敏检测和活细胞成像。设计核壳状的纳米探针,包括作为载体和辅因子提供者的ZnO纳米粒子(ZnO NPs)核和用于吸附功能性发夹DNAs的聚多巴胺壳。在碱性条件下,多巴胺通过自聚过程沉积在ZnO NPs的表面上。功能性发夹DNAs通过π-π相互作用吸附在聚多巴胺壳上。当ZnO纳米探针通过细胞内吞作用进入细胞后,细胞内的酸性环境会使ZnO NPs核降解,释放出功能性发夹DNAs和Zn2+。释放出的Zn2+可以作为辅因子催化DNAzyme切割扩增反应的进行,避免了额外的辅因子细胞递送过程。识别发夹DNA包括目标物的识别序列和被锁住的DNAzyme区域。报告发夹DNA包括DNAzyme的底物部分和标记在末端的荧光团和猝灭剂。识别发夹DNA识别miRNA后暴露出DNAzyme区域。暴露出的DNAzyme区域在Zn2+的存在下切割报告发夹DNA的底物部分,荧光团和猝灭剂相互远离,使荧光恢复。释放出的识别发夹DNA和miRNA的杂交双链继续循环切割报告发夹DNA,产生增强的荧光信号用于灵敏检测miR-21和miR-373,检测限分别为54 pM和38 pM。本策略对叁种细胞内miR-21的不同表达水平进行了区分,而且在同一种活细胞内对miR-21和miR-373进行了同时成像。以上结果表明,本策略在癌症准确诊断和治疗领域的miRNA多重分析中具有潜在应用。第五章,构建了基于MNAzyme切割扩增反应的DNA逻辑平台用于癌症风险评估和癌细胞鉴别。MNAzyme是指分裂式的DNAzyme。在DNAzyme的催化中心处分裂后添加目标物的传感臂,形成两条独立的催化链Part A和Part B。当miRNA不存在时,Part A和Part B独立存在,不能形成完整的催化中心,无法切割底物链,保证了较低的背景信号。当miRNA存在时,Part A和Part B的目标物传感臂能够同时识别miRNA,形成完整的MNAzyme复合物。该复合物绑定底物链,在Mrn2+的辅助下循环切割底物链,产生增强的荧光信号用于癌症风险评估和癌细胞鉴别。将本策略用于癌细胞鉴别时,由于细胞内的金属离子不足以催化MNAzyme切割扩增反应的进行,MnO2纳米片被作为探针入胞的载体。MnO2纳米片能够在细胞内谷胱甘肽(GSH)的作用下降解产生辅因子Mn2-,催化MNAzyme切割扩增反应的进行。本工作通过YES、AND、XOR、NOR逻辑门的构建实现癌症风险评估和癌细胞鉴别。实验结果表明,本平台能够为癌症风险评估和癌细胞鉴别提供一种可替换的逻辑门构建方法。第六章为结论部分,主要包括本论文的创新点和前景展望。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-27）
王帅[2]（2019）在《纳米材料介导的比率荧光生物传感器的构建用于microRNA检测及活细胞成像》一文中研究指出MicroRNAs(miRNAs)是一类短的(约18-24个核苷酸)、内源性、非编码RNA分子。miRNA通过调节mRNA的降解或抑制其翻译调控基因的表达从而调控各种生物过程,包括细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡等。大量研究表明,miRNA的异常表达与癌症、心血管疾病和阿尔茨海默病等各种疾病密切相关,可作为疾病诊断和预后的潜在标志物。实现细胞内miRNA的可视化检测对于更好地了解其在细胞周期中的作用并进一步阐明其在临床诊断中的生物学功能至关重要。基于以上分析,构建了纳米材料介导的比率荧光生物传感器,实现了miRNA灵敏、准确检测并将其用于细胞成像。本文共分为叁章:第一章为绪论,主要概述了 miRNA的产生、形成机制、研究意义以及目前国内外已有的miRNA传统和新型检测方法,并介绍了本文主要解决的科学问题和研究内容。第二章构建了 MnO2纳米片介导的比率荧光生物传感器,并用于miRNA的检测和细胞内成像。该生物传感器由叁部分组成:可用作DNA载体的MnO2纳米片、荧光供体FAM标记的发夹探针H1(识别探针)以及荧光受体TAMRA标记的发夹探针H2(放大探针)。当传感器进入细胞后,MnO2纳米片被细胞内谷胱甘肽还原为Mn2+,同时,释放被吸附的发夹探针H1和H2。细胞内目标miRNA-21与H1的识别单元杂交以启动催化发夹自组装(Catalyzed hairpin assembly,CHA)并产生大量的H1-H2双链体。这使荧光供体FAM和荧光受体TAMRA相互靠近并产生荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),使供体信号降低,受体信号增强,诱导比率荧光响应,从而实现miRNA-21的检测。此外,该方法可以用于区分HeLa、HepG-2和L02细胞中miRNA-21的表达水平。这些结果表明,该生物传感器在miRNA相关疾病的早期诊断中具有很大的应用价值。第叁章基于多重FRET构建生物编码荧光传感器,用于miRNA的多重检测和细胞内成像。该传感器由MnO2纳米片和四条单链DNA探针(P1-AF 488、P2-Cy3、P3-AF488和P4-AF594)组成。作为DNA纳米载体,MnO2纳米片可以通过细胞的内吞作用将探针递送进细胞。探针P1-AF 488和探针P2-Cy3序列与miRNA-373部分互补,探针P3-AF 488和P4-AF 594序列与miRNA-96部分互补。当探针被递送进细胞后,在相应目标miRNA的存在下,P1-AF 488和P2-Cy3以及P3-AF 488和P4-AF 594形成双链结构,使供体和受体相互靠近发生FRET,从而使荧光信号发生改变。此外,可以将输出的特定的荧光颜色作为代码,将miRNA的存在情况转换为不同的荧光颜色信号,实现miRNA的多重检测。这些结果表明,该生物传感器为细胞内miRNA的同时检测提供了新工具,有望为癌症的诊断和治疗提供更准确的信息。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-27）
曹永,吕强,孙迎燕,高晓虹[3]（2019）在《靶向纳米探针在结直肠癌干细胞荧光成像及光热治疗中的研究》一文中研究指出目的制备CD44v6功能化上转换纳米粒子(UCNPs)探针,用于结直肠癌肿瘤干细胞(CSC)的早期诊断及光热治疗研究。方法采用热解法制备NaYF_4:Yb,Er/Tm纳米粒子,检测其表征及对细胞的毒性;然后与CD44v6抗体耦联,制备成可以检测CD44v6~+细胞的UCNPs探针;用荧光显微镜观察CD44v6UCNPs探针的靶向作用;体外进行CD44v6UCNPs对结直肠癌CSC光热治疗。结果 UCNPs对肿瘤细胞无毒性;成功制备CD44v6UCNPs探针;实现体外结直肠癌CSC的靶向荧光成像和光热治疗。结论成功制备靶向UCNPs探针并将其应用于结直肠癌CSC的荧光成像及光热治疗。(本文来源于《重庆医学》期刊2019年08期）
李彦杰[4]（2019）在《基于ESIPT和AIE探针的活细胞和脂滴实时荧光成像研究》一文中研究指出聚集诱导发光(Aggregation-induced emission,AIE)这一概念自2001年被提出以来,对有机发光材料和生物医学等领域产生了重大且深远的影响。聚集诱导发光试剂(AIE Luminogens,AIEgens)作为一种具有高稳定性、高可见度的光学成像探针,已在精准定位生物成像、胞内物质测定、动态过程实时监控、药物可视化传输等众多领域展现出广阔的应用前景。其中,AIEgens精准的亚细胞结构定位能力是一项重要的基础性研究,对其在生物医学成像领域的广泛应用发挥了不可替代的作用。线粒体、溶酶体、细胞膜、脂滴等亚细胞结构的特异性染色和点亮的AIEgens的特征和规律总结,为指导特定功能分子探针的设计和丰富分子载体材料的选择提供了重要的参考价值。近年来功能性AIEgens的报道层出不穷,进一步拓展了其在生物成像分析领域的应用范围,因此系统性地研究这些新兴AIEgens的成像性质和定位能力是必要且重要的。其中激发态分子内质子转移(Excited-state intramolecular proton transfer,ESIPT)荧光功能分子的细胞成像性能研究、天然药物分子的AIE性质研究和成像应用、兼具优异发光性能和精准定位能力的AIEgens的开发和成像应用,都具有较高的研究价值且被广泛关注。然而这些方面的研究工作尚处于起步阶段,并且存在一些噬待解决的问题。首先,ESIPT类AIEgens的质子转移核心结构需要完好地保留,因此对其进行结构改性往往仅限于从取代基部位着手,如此一来对整体分子的发光性能和成像性能难以做到多方位高效调控。其次,将天然药物的AIE性能优势用于其细胞内分布和药物作用过程的成像研究,则需要完美地契合药物的发光条件和药物分布及作用位点的生理环境,故而研究模型的建立需遵从药物的客观属性。再者,具有AIE性质的天然药物分子种类鲜有报道,且性能固定难以有效调控,所以针对性地设计和筛选发光性能优异的精准定位成像探针仍是迫切需要的。发光性能能够可控调节的智能型分子显然将会备受欢迎,但是开发难度较大。上述问题显然会给研究者带来分子设计和成像应用等方面的更高要求。本论文围绕上述的研究难点和问题,借鉴前人的研究工作基础,在具有高效跨膜成像性能的ESIPT类AIEgens的筛选和成像应用、天然药物盐酸小檗碱的AIE性质用于脂滴的实时原位荧光成像和降脂作用研究、以及兼具刺激响应接口和精准脂滴定位能力的AIEgens的设计和细胞脂滴成像应用研究等方面开展了如下具体的工作:1.高跨膜性能ESIPT类AIEgen的制备和细胞成像应用选定水杨醛和对二甲氨基苯胺通过醛胺缩合反应制备的席夫碱作为ESIPT类系列分子的母核结构。固定其中的二甲氨基苯胺,采用具有不同取代基的水杨醛分子来构建含有不同取代基的4-N,N-二甲基氨基苯胺水杨醛席夫碱(4-N,N-dimethylaminoaniline salicylaldehyde Schiff-bases,DSS)系列分子。四种细胞系成像考察结果证实二乙胺基功能化的DSS分子(DSS-4-DEA)较之于其他四种同系列分子具有显着优异的细胞穿透能力,能够有效地跨过细胞膜进入并点亮细胞。质子转移核心结构中具有近距离空间排布的羟基氧和亚胺氮原子,可以与多种金属离子配位,考察结果表明DSS系列分子均具有铜离子识别特性,表现出铜离子猝灭的荧光信号响应。DSS-4-DEA从而可以用于铜离子的定量检测和细胞成像传感。此外,DSS-4-DEA能够用作高效的跨膜载体显着提升细胞穿透力低的DSS-5-Br分子和强疏水药物姜黄素的细胞内递送,实现双色成像和增强的抗癌活性,证实了DSS-4-DEA的多功能应用。2.脂代谢干预中盐酸小檗碱的AIE实时成像研究选定具有AIE性质的不同阴离子的小檗碱(Berberine,BBR)系列分子,考查其AIE性质。AIE曲线显示,阴离子引起的BBR溶解性的差异对发光强度起到调节作用,结果表现为水溶性差的硫酸小檗碱(Berberine sulfate,BBR-HSO_4)具有较之于BBR和盐酸小檗碱(Berberine hydrochloride,BBR-Cl)更强的荧光。但叁者的发光强度均可以满足荧光成像要求,故而选择临床最为常用的BBR-Cl作为后续的降脂调控作用的成像研究。构建诱导形成3T3脂肪细胞模型以及油酸喂养形成的HeLa细胞模型,将BBR-Cl用作降脂药物来研究两种细胞的脂肪代谢的调节。借助BBR-Cl在脂肪环境中特定的富集及其在脂滴中聚集状态下发出绿色荧光,系统地研究7.5?M的BBR-Cl自身在细胞内分布和代谢速率,及其脂代谢干预中脂滴含量的动态变化过程的实时成像分析。实时成像分析结果与油红O固定染色法结果基本吻合,充分体现了BBR-Cl的降脂治疗和荧光探针的双功能应用。3.脂滴定位AIEgen TPA-CN的制备和高灵敏成像研究依据脂滴定位AIEgens的结构规律和设计原则,通过选用可外界刺激响应的亚胺键作为连接节点,构建兼具刺激应答性能和脂滴定位性能的AIEgen。其中电子供受体对分别选用叁苯胺和苯甲腈结构,则制备的TPA-CN分子较之于叁苯胺-醛基结构具有红移的发光波长。该席夫碱结构具有一定的稳定性,对低于pH 4.35的酸度有响应,光谱研究结果表现为酸性条件下发光波长从530 nm到480 nm的蓝移,原因归结为酸触发的断键引起的共轭结构减小。采用商用的红色荧光脂滴染料尼罗红与TPA-CN进行共定位成像研究,结果表明TPA-CN具有高效的脂滴定位成像能力,且对小粒径脂滴的成像可见度更高。高的光稳定性和信背比使得TPA-CN可以用于细胞内脂滴的高灵敏成像观察,并且可用于脂滴的亚微米动态位置信息的精准获取。总之,本论文探索性地对具有DSS核心结构的系列ESIPT分子的细胞穿透成像能力进行了考察和研究,筛选出的DSS-4-DEA可以用于细胞内铜离子的荧光传感,同时作为跨膜载体实现荧光染料和药物的高效运载。合理利用BBR-Cl的绿色荧光实现了其同时作为药物分子和成像剂,在无外加荧光指示剂的情况下可视化成像观察了BBR-Cl对脂代谢干预过程的调控。此外,制备了刺激响应型的AIEgen TPA-CN,具有酸触发的荧光波长蓝移性质,并成功用作脂滴的精准定位以及高灵敏动态成像分析工具。(本文来源于《西南大学》期刊2019-03-25）
陈慧新,何济,朱灵利,王亮[5]（2019）在《含苝聚几内酯荧光微球的制备及其用于细胞荧光成像的研究》一文中研究指出本论文首先以苝二酸酐和二甘醇胺为原料合成得到了苝酰亚胺羟基衍生物(PBI-OH),再以PBI-OH作为引发剂引发ε-己内酯开环聚合,得到了具有荧光性的含苝聚己内酯(PBI-PCL). PBI-PCL的结构采用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和核磁共振氢谱(1H-NMR)来确定,其光学性质采用紫外吸收光谱(UV-Vis)和荧光激发光谱(FL)来表征.随后将PBI-PCL采用乳化-溶剂挥发法将其制备成纳米微球,并采用激光粒度仪对其粒径和分布进行表征.以该微球为荧光标记物,分别对L929和Hela细胞进行荧光标记研究.综上,PBI-PCL是一种具有优良自荧光性能的可降解聚酯材料,其纳米微球可作为多种细胞的荧光标记物使用,有望成为一种有竞争力的荧光标记材料.(本文来源于《天津理工大学学报》期刊2019年01期）
蔡阳,冀辰东,张少博,苏志强,尹梅贞[6]（2018）在《基于扇形PAMAM树枝制备的水溶性荧光树枝状分子及其长效活细胞荧光成像（英文）》一文中研究指出亲水聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状分子能够提高荧光染料水溶性和生物相容性,被广泛应用于生物荧光成像、药物、基因递送等领域.本文报道了一系列以扇形PAMAM为树枝,以荧光染料为核的水溶性荧光树枝状分子.扇形PAMAM树枝可通过酰胺化反应与羧基化的苝酰亚胺(PBI)和吲哚方酸菁(SICy)染料相连.随后,我们进一步研究了PBI系列树枝状分子的物理性质及生物性能. PBI-G2.5具有良好的水溶性,强荧光发射,并能在水中自组装形成30 nm的纳米粒子.细胞实验表明, PBI-G2.5被细胞摄取后在细胞质富集,且48小时后仍可检测到强的荧光.因此,本合成方法可以有效制备水溶性、生物相容性良好的荧光树枝状分子,并在长效活细胞荧光成像中有应用前景.(本文来源于《Science China Materials》期刊2018年11期）
汪文杰,朱龙,江玉亮,韦国[7]（2018）在《一种基于荧光素的新型荧光探针用于快速检测次氯酸及在活细胞成像中的应用》一文中研究指出作为生物系统中一种主要的活性氧(ROS),次氯酸/次氯酸盐(HClO/ClO~-)在免疫系统中扮演重要的角色,过量的次氯酸会引发很多疾病。因此,次氯酸的高灵敏检测对疾病早期预测具有重要意义。基于此,设计并合成了一种基于荧光素的新型荧光探针并用于检测次氯酸。结果表明,该探针能够快速、高灵敏地检测次氯酸,其检测限低至0.50μmol/L。同时,通过对活细胞成像的研究表明,该探针具有潜在的生物应用前景。(本文来源于《化学试剂》期刊2018年09期）
邓邦莲,陈雪峰,秦文,刘龑,孟蕾[8]（2018）在《碳量子点对神经细胞荧光成像及生物安全性评价》一文中研究指出目的:检测碳量子点对神经细胞的生物成像效果,及其生物安全性评估。方法:使用动态光散射法和荧光分光光度计对碳量子点进行表征,使用共聚焦显微镜观察碳量子点的生物成像效果,用MTT法检测碳量子点对细胞的毒性效应。结果:碳量子点光学效应好,激发光为375nm时,碳量子点荧光强度最强,而且碳量子点荧光强度与其浓度正相关。碳量子点可被PC12细胞摄取并发出明亮的荧光,显示出良好的荧光成像效应。同时发现,碳量子点对PC12细胞毒性低,500μg/m L碳量子点孵育48h后,细胞活力仍保持在70%以上。结论:碳量子点荧光成像特性优异,生物安全性好,在口腔医学领域应用时不会造成神经系统损伤。(本文来源于《口腔颌面修复学杂志》期刊2018年04期）
郑爱仙,张晓龙,刘小龙[9]（2018）在《核酸功能化纳米探针在细胞荧光成像中的应用》一文中研究指出核酸是携带遗传信息的物质,既存在于自然界中也能够通过成熟技术人工合成。通过体外筛选技术还可以筛选出具有特殊功能的核酸序列,例如核酸适体和脱氧核酶。核酸通过沃森-克里克碱基互补配对原则进行杂交,具有很强的专一性。无论是通过序列设计还是体外筛选,核酸探针在生物标志物的分析与成像应用方面都发挥着重要作用。纳米材料辅助构建核酸功能化纳米探针,可以保护负载的核酸探针不被核酸酶降解,并且无需转染试剂就能进入细胞,在细胞荧光成像应用上具有很大优势。为解决细胞内有些生物标志物含量低、难于检测的问题,目前已构建多种适用于细胞水平的成像信号放大方法来实现对低丰度生物标志物的高灵敏成像。本文主要综述了核酸功能化纳米探针在细胞荧光成像中的应用进展,包括反义寡核苷酸功能化纳米探针、核酸适体功能化纳米探针、脱氧核酶功能化纳米探针等,同时介绍了他们在成像信号放大中的应用。(本文来源于《中国光学》期刊2018年03期）
张若瑶[10]（2018）在《原位成像/追踪线粒体以及原位成像质膜超微结构的长烷基链型活细胞荧光探针的研制》一文中研究指出生物荧光探针是功能材料的重要门类,在生命科学和医学基础与应用研究中起到重要作用。线粒体和细胞质膜是极其重要的细胞器,在细胞的生命活动中扮演重要角色。本论文的研究集中在以下方面:①在活性组织中直接、原位成像线粒体的荧光探针;②在活细胞中实时追踪线粒体的荧光探针;③原位成像细胞质膜的荧光探针;④同时、原位、双色区别成像细胞质膜内脂筏与非脂筏两种超微结构的荧光探针。人工体外培养的细胞与组织中的原生态细胞有很大差异。因此,在组织中直接、原位成像线粒体能够给出其更加本征、准确的信息。特别是在线粒体疾病的临床诊断中,观察病人肌肉组织中的线粒体形态和数量是一个常规检测项目。然而,由于组织中的成分比离体细胞更加复杂,对线粒体探针的选择性提出了更高的要求,现有的线粒体荧光探针无法在组织中高选择性地成像线粒体。为了解决这一问题,我们提出利用“双靶向基团”提高探针选择性的理念,在传统阳离子型线粒体探针上引入对线粒体内膜具有靶向作用的十八碳长烷基链,得到对线粒体具有超高选择性的荧光探针Mito-MOI。其中,阳离子盐作为第一个靶向基团与线粒体膜电位产生静电相互作用,同时长烷基链作为第二靶向基团,通过与磷脂的疏水相互作用力嵌入线粒体内膜磷脂中。因此,双靶向基团与线粒体的双重作用赋予了 Mito-MOI超高选择性。利用Mito-MOI我们得到了线粒体内膜的高分辨荧光图片,并且在完整的活性组织中获得了高保真的线粒体荧光图片。特别是在骨骼肌组织中,我们看到了四种线粒体以及它们的晶格状规整的网状结构。另外,Mito-MOI可以实时追踪线粒体裂分的动态过程,也同时具有优秀的光稳定性和低毒性。双靶向基团提高选择性的策略对于设计细胞内其他膜性细胞器的超高选择性探针具有指导性意义。与原位、静态的成像线粒体相比,长程、实时、原位、动态追踪线粒体具有更大意义。然而现有的线粒体荧光探针高度依赖于线粒体膜电位,线粒体膜电位降低会带来探针脱落,难以实现对线粒体的长程追踪。为解决这一问题,目前线粒体追踪探针的设计普遍采用“反应型”策略,引入可与线粒体蛋白上的巯基或氨基发生反应的官能团,通过共价键实现对线粒体的绑定作用,然而此方法会对线粒体造成破坏。为解决上述问题,我们用弱相互作用代替共价键,利用长烷基链与磷脂双分子层的较强疏水作用,在咔唑-吡啶盐和吲哚-吡啶盐上分别引入十二碳烷基链,合成出可长程追踪线粒体且不破坏线粒体蛋白的“非反应型”线粒体追踪探针,ECPI-12与IVPI-12。在染色时,阳离子部分因静电相互作用位于线粒体内膜的面向线粒体基质的表面,长烷基链可以嵌入到线粒体内膜的疏水区域。线粒体膜电位降低或消失时,尽管阳离子盐与内膜电位的静电相互作用会消失,但是长烷基链的疏水相互作用仍然能够使探针固定在线粒体上。该作用属于非共价键的作用,不会对线粒体的蛋白质造成破坏。实验结果表明,两个探针可以在活细胞中染色线粒体,尤其是在线粒体膜电位降低或消失时,它们仍然可以固定在线粒体上。通过与其对应的短链分子ECPI-2和IVPI-2的对照实验,我们证明了长烷基链的线粒体绑定作用使得ECPI-12和IVPI-12在线粒体膜电位降低后仍可保留在线粒体上。此外,细胞毒性实验表明ECPI-12和IVPI-12比“反应型”追踪探针具有更低的毒性,表明疏水相互作用比共价键更加温和,对线粒体的破坏更小。我们还利用ECPI-12和IVPI-12实时追踪了线粒体自噬过程。此外,它们具有较好的双光子性质,能够用于深层组织成像。ECPI-12和IVPI-12可用于在生理或病理过程中,追踪活细胞和组织中的线粒体动态变化。双光子激发荧光(TPEF)成像具有对样品穿透深度较深、背景噪声较低、光毒性和光漂白较小等优点。因此,开发TPEF探针对于生物成像具有重要意义。细胞质膜是细胞与胞外环境的交流媒介,与信号转导、胞吞胞吐、离子交换等多种生命活动息息相关。因此,在细胞中成像细胞质膜可以使人们更加深入了解与其相关的生理过程。尽管目前关于细胞质膜探针的报道很多,但是关于双光子细胞质膜探针的报道非常少,并且具有双光子活性截面(δ× Φ)较低、在细胞质膜上成像效果较差等问题。为解决上述问题,我们以咔唑-吡啶盐体系为平台,合成了一个具有良好双光子性质的细胞质膜探针ECPI-18。在860 nm激发时,该探针具有较大的双光子吸收截面和双光子活性吸收截面,分别为991 GM和150 GM,表明该探针具有良好的双光子性质。ECPI-18可用于双光子成像,可以在活细胞中清晰成像细胞质膜。此外,MTT实验表明ECPI-18具有较低的毒性,多染实验表明其与细胞核探针及线粒体探针具有较好的共染兼容性。细胞质膜内含有脂筏与非脂筏两种具有不同功能的超微结构,其分工协作在生命过程中起着重要作用。细胞质膜的脂筏微区与信号转导、蛋白簇形成等生理活动有关,非脂筏微区与T细胞抗原受体的纳米团簇形成有关。因此,在活细胞质膜上区分成像脂筏/非脂筏微区对于相关生理、病理过程研究具有促进作用。目前可成像细胞质膜脂筏/非脂筏微区的探针极少,并且具有信噪比低、在细胞质膜上成像效果较差等问题。为解决上述问题,我们结合转子效应和分子内电荷转移原理,以转子效应提高保真度,以分子内电荷转移实现对细胞质膜微区的选择性,设计合成出可以高保真区分成像细胞质膜脂筏/非脂筏微区的荧光探针DSPI-18。在人工囊泡的实彩成像中,DSPI-18在脂筏微区呈现绿色荧光,在非脂筏微区呈现红色荧光,在两个微区的荧光差异约为50 nm。在细胞成像中,DSPI-18能够较长时间驻留在细胞质膜上,并能够高保真成像细胞质膜。在细胞的实彩成像中,我们发现DSPI-18在SiHa细胞的细胞膜上呈现清晰的橘红色和绿色的荧光,以两种荧光颜色区分成像脂筏/非脂筏微区。这些结果表明DSPI-18在研究脂筏/非脂筏微区方面具有应用前景,且结合转子效应和分子内电荷转移原理设计高信噪比探针的思路切实可行。综上所述,我们设计合成了具有“双靶向基团”的线粒体探针,利用双靶向作用提高探针选择性,并利用该探针实现了高清晰成像完整活性组织中的线粒体;利用长烷基链与磷脂双层的疏水作用,设计合成出能够长程追踪线粒体,并且不破坏线粒体蛋白的“非反应型”线粒体探针;以咔唑-吡啶盐体系为平台,合成了一个具有良好双光子性质的细胞质膜探针;结合转子效应和分子内电荷转移原理,设计合成出可以高保真区分成像细胞质膜脂筏/非脂筏微区的荧光探针。从基础研究角度,本论文的工作揭示了探针设计的新策略,并对于其他探针的设计具有启发性;从应用研究角度,这些探针有助于生物学与医学工作对线粒体和细胞质膜进行深入的研究。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-28）
活细胞荧光成像论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
MicroRNAs(miRNAs)是一类短的(约18-24个核苷酸)、内源性、非编码RNA分子。miRNA通过调节mRNA的降解或抑制其翻译调控基因的表达从而调控各种生物过程,包括细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡等。大量研究表明,miRNA的异常表达与癌症、心血管疾病和阿尔茨海默病等各种疾病密切相关,可作为疾病诊断和预后的潜在标志物。实现细胞内miRNA的可视化检测对于更好地了解其在细胞周期中的作用并进一步阐明其在临床诊断中的生物学功能至关重要。基于以上分析,构建了纳米材料介导的比率荧光生物传感器,实现了miRNA灵敏、准确检测并将其用于细胞成像。本文共分为叁章:第一章为绪论,主要概述了 miRNA的产生、形成机制、研究意义以及目前国内外已有的miRNA传统和新型检测方法,并介绍了本文主要解决的科学问题和研究内容。第二章构建了 MnO2纳米片介导的比率荧光生物传感器,并用于miRNA的检测和细胞内成像。该生物传感器由叁部分组成:可用作DNA载体的MnO2纳米片、荧光供体FAM标记的发夹探针H1(识别探针)以及荧光受体TAMRA标记的发夹探针H2(放大探针)。当传感器进入细胞后,MnO2纳米片被细胞内谷胱甘肽还原为Mn2+,同时,释放被吸附的发夹探针H1和H2。细胞内目标miRNA-21与H1的识别单元杂交以启动催化发夹自组装(Catalyzed hairpin assembly,CHA)并产生大量的H1-H2双链体。这使荧光供体FAM和荧光受体TAMRA相互靠近并产生荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),使供体信号降低,受体信号增强,诱导比率荧光响应,从而实现miRNA-21的检测。此外,该方法可以用于区分HeLa、HepG-2和L02细胞中miRNA-21的表达水平。这些结果表明,该生物传感器在miRNA相关疾病的早期诊断中具有很大的应用价值。第叁章基于多重FRET构建生物编码荧光传感器,用于miRNA的多重检测和细胞内成像。该传感器由MnO2纳米片和四条单链DNA探针(P1-AF 488、P2-Cy3、P3-AF488和P4-AF594)组成。作为DNA纳米载体,MnO2纳米片可以通过细胞的内吞作用将探针递送进细胞。探针P1-AF 488和探针P2-Cy3序列与miRNA-373部分互补,探针P3-AF 488和P4-AF 594序列与miRNA-96部分互补。当探针被递送进细胞后,在相应目标miRNA的存在下,P1-AF 488和P2-Cy3以及P3-AF 488和P4-AF 594形成双链结构,使供体和受体相互靠近发生FRET,从而使荧光信号发生改变。此外,可以将输出的特定的荧光颜色作为代码,将miRNA的存在情况转换为不同的荧光颜色信号,实现miRNA的多重检测。这些结果表明,该生物传感器为细胞内miRNA的同时检测提供了新工具,有望为癌症的诊断和治疗提供更准确的信息。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
活细胞荧光成像论文参考文献
[1].王瑞.癌症相关microRNA的荧光生物传感及活细胞成像方法研究[D].山东大学.2019
[2].王帅.纳米材料介导的比率荧光生物传感器的构建用于microRNA检测及活细胞成像[D].山东大学.2019
[3].曹永,吕强,孙迎燕,高晓虹.靶向纳米探针在结直肠癌干细胞荧光成像及光热治疗中的研究[J].重庆医学.2019
[4].李彦杰.基于ESIPT和AIE探针的活细胞和脂滴实时荧光成像研究[D].西南大学.2019
[5].陈慧新,何济,朱灵利,王亮.含苝聚几内酯荧光微球的制备及其用于细胞荧光成像的研究[J].天津理工大学学报.2019
[6].蔡阳,冀辰东,张少博,苏志强,尹梅贞.基于扇形PAMAM树枝制备的水溶性荧光树枝状分子及其长效活细胞荧光成像（英文）[J].ScienceChinaMaterials.2018
[7].汪文杰,朱龙,江玉亮,韦国.一种基于荧光素的新型荧光探针用于快速检测次氯酸及在活细胞成像中的应用[J].化学试剂.2018
[8].邓邦莲,陈雪峰,秦文,刘龑,孟蕾.碳量子点对神经细胞荧光成像及生物安全性评价[J].口腔颌面修复学杂志.2018
[9].郑爱仙,张晓龙,刘小龙.核酸功能化纳米探针在细胞荧光成像中的应用[J].中国光学.2018
[10].张若瑶.原位成像/追踪线粒体以及原位成像质膜超微结构的长烷基链型活细胞荧光探针的研制[D].山东大学.2018