羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定和间接ELISA检测方法的建立及应用

论文摘要

伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis,C.p）是一种可引发山羊、绵羊、牛和骆驼等多种动物感染并出现淋巴结和内脏器官肿大、局部干酪样坏死等病理变化的重要病原菌,绵羊、山羊感染后引发的疾病通常被称为羊干酪性淋巴结炎（caseous lymphadenitis,CLA）。除上述病理变化外,CLA作为一种渐进性和消耗性的慢性传染病,还可导致患病羊生产性能下降以及繁殖障碍,已经造成巨大经济损失并严重制约养羊业的发展。由于其病程缓慢和致死率低等特点,在临床生产上常容易忽视其发病感染而造成更大损失。目前为止在我国奶山羊的主要养殖区域都有该病原感染发病的相关报道,但目前国内尚无防控该病的疫苗且抗生素的治疗效果不甚理想,因此针对该病原建立一种有效、准确的检测方法也许能够为后续隔离、淘汰、净化等处理措施提供参考依据。本研究从陕西关中部分地区采集大量疑似羊干酪性淋巴结炎病变的脓肿样品,利用细菌分离纯化培养、生化特性试验和16S rRNA PCR测序等方法对分离菌进行鉴定并进行动物致病性试验,同时检测分离菌株的最小抑菌浓度,参照EUCAST 2017欧盟药物敏感性试验标准进行结果判定;选择伪结核棒状杆菌的主要毒力因子磷脂酶D（PLD）作为候选基因,通过构建pET-28a-sumo-PLD重组质粒对其进行原核表达及蛋白溶解纯化,利用灰度分析软件Image-Pro Plus对蛋白浓度进行测定并通过Western blot对其进行验证,表明重组PLD融合蛋白可与其阳性血清发生特异性反应;用已经表达纯化好的PLD融合蛋白作为包被抗原,通过对最佳抗原包被浓度和血清稀释比例的筛选、封闭液的选择、兔抗羊酶标二抗稀释比的优化以及阳性临界值的确定,建立了间接ELISA检测方法,同时通过试验对其敏感性、特异性以及重复性进行了评估,并应用该方法对来源于陕西耀州、陇县、富平的186份羊血清样品进行血清学调查。试验结果如下:1.分离菌株在37℃恒温箱培养48 h后,在营养琼脂上生长稀疏、贫瘠,血琼脂生长良好并形成大小约为1 mm2 mm,白色或淡黄色干燥易推动的菌落;革兰氏染色阳性、菌体形态呈小球状。结合菌落形态以及生化试验和16S rRNA PCR测序鉴定结果,确定为伪结核棒状杆菌,且可感染小鼠引起干酪样脓肿病变。对分离的32株伪结核棒状杆菌进行最小抑菌浓度检测,结果表明,分离菌株对于青霉素耐药率为21.9%（7/23）,对庆大霉素耐药率为12.5%（4/32）,对克林霉素和利奈唑胺均敏感。2.利用构建好的pET-28a-sumo-PLD重组质粒对磷脂酶D（PLD）进行融合表达,结果表明其主要存在形式为包涵体,纯化后浓度为2.63mg/ml,Western blot试验结果表明表达的PLD融合蛋白可与其阳性血清发生特异性反应。3.将表达纯化的PLD融合蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法,试验结果表明最佳抗原包被浓度为1.64μg/mL,最佳血清稀释比为1:200,酶标二抗稀释比为1:5000,通过对48份健康新生羔羊脐带血进行检测确定阳性临界值为0.368。当阳性血清稀释比为1:1600时,OD450检测值仍高于阳性临界值;同时与羊口疮、羊乳房炎和羊溶血曼氏杆菌阳性血清无交叉反应,批内重复试验的变异系数范围在3%10.5%之间,批间重复变异系数范围为5%15%,说明了该间接ELISA检测方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。4.利用所建立的间接ELISA检测方法对陕西关中地区186份奶山羊血清进行检测,其中阳性样品42份,整体阳性率为22.6%（42/186）。结合以上试验结果表明,成功地分离到了32株伪结核棒状杆菌;所分离的伪结核棒状杆菌菌株对多种抗生素敏感,整体耐药情况不严重;用表达得到的伪结核棒状杆菌磷脂酶D融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA诊断方法,具有特异性强、准确率高、重复性优良等特点,能够用于羊群伪结核棒状杆菌的血清学诊断。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 文献综述
•   第一章 伪结核棒状杆菌的研究进展
•     1.1 病原学
•     1.2 主要毒力因子的研究
•       1.2.1 磷脂酶D（PLD）
•       1.2.2 分支菌酸
•       1.2.3 铁摄取和调节相关因子
•       1.2.4 其他相关毒力因子
•     1.3 临床症状和病理变化
•       1.3.1 体表型
•       1.3.2 内脏型
•       1.3.3 混合型
•     1.4 诊断
•       1.4.1 病原学诊断
•       1.4.2 血清学诊断
•       1.4.3 分子生物学诊断方法
•     1.5 发病机理与免疫应答
•     1.6 疫苗的研究概况
•       1.6.1 灭活疫苗
•       1.6.2 类毒素疫苗
•       1.6.3 活疫苗
•       1.6.4 重组亚单位苗
•     1.7 药物敏感性
•     1.8 流行病学概况
•       1.8.1 流行特点和感染途径
•       1.8.2 我国的CLA流行现状
•       1.8.3 国外的流行情况
• 试验研究
•   第二章 羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定
•     2.1 试验材料和方法
•       2.1.1 脓汁病料
•       2.1.2 实验动物
•       2.1.3 主要试剂
•       2.1.4 主要仪器设备
•       2.1.5 主要溶液及培养基配制
•       2.1.6 脓汁样品采集
•       2.1.7 脓汁涂片、革兰氏染色、镜检
•       2.1.8 脓汁样品病原菌的分离纯化
•       2.1.9 菌落染色镜检
•       2.1.10 生化鉴定
•       2.1.11 纯培养物菌液制备
•       2.1.12 16S rRNA PCR鉴定
•       2.1.13 小鼠致病性试验
•       2.1.14 微量肉汤稀释法检测最小抑菌浓度（MIC）
•     2.2 结果
•       2.2.1 脓汁涂片染色镜检
•       2.2.2 C.p的菌落形态和镜检特征
•       2.2.3 生化鉴定结果
•       2.2.4 16S rRNA PCR鉴定及测序结果
•       2.2.5 MIC试验结果
•       2.2.6 小鼠感染试验结果
•     2.3 讨论
•   第三章 伪结核棒状杆菌PLD融合蛋白的原核表达及纯化
•     3.1 材料与方法
•       3.1.1 材料
•       3.1.2 方法
•     3.2 试验结果
•       3.2.1 重组表达载体pET-28a-sumo-PLD的鉴定
•       3.2.2 PLD融合表达蛋白的表达与检测
•       3.2.3 PLD融合蛋白表达条件的优化
•       3.2.4 PLD包涵体蛋白纯化和Western blot
•     3.3 讨论
•     3.4 小结
•   第四章 间接ELISA检测方法的建立及应用
•     4.1 材料
•       4.1.1 包被抗原和试验血清
•       4.1.2 主要试剂
•       4.1.3 主要溶液及其配置
•     4.2 方法
•       4.2.1 间接ELISA检测方法的建立
•       4.2.2 间接ELISA检测条件的优化
•       4.2.3 阳性临界值的确定
•       4.2.4 敏感性试验
•       4.2.5 特异性试验
•       4.2.6 重复性试验
•       4.2.7 间接ELISA检测方法的初步临床应用和血清学调查
•     4.3 结果
•       4.3.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数
•       4.3.2 间接ELISA最佳工作条件的确定
•       4.3.3 阳性临界值的确定
•       4.3.4 敏感性试验
•       4.3.5 特异性试验
•       4.3.6 重复性试验
•       4.3.7 检测方法的初步应用
•       4.3.8 血清学调查结果
•     4.4 讨论
•     4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 魏宇辰

导师: 杨增岐

关键词: 伪结核棒状杆菌,磷脂酶,原核表达,间接酶联免疫吸附试验

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家绒毛用羊产业技术体系项目(编号:CARS-39-14),农业农村部动物源细菌耐药监测计划

分类号: S852.61

总页数: 65

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