导读:本文包含了条件复制腺病毒论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:前列腺癌,腺病毒,hTERT,EZH2
条件复制腺病毒论文文献综述
许士高[1]（2019）在《hTERT及EZH2-shRNA双调控条件复制型腺病毒对前列腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响》一文中研究指出去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)较激素敏感性前列腺癌(hormone-sensitive prostate cancer,HSPC)治疗难度大,且预后较差,因此有必要开拓新的治疗方法,而基因疗法则是目前较为热门的治疗恶性肿瘤的方法,引起科研工作者的广泛关注。基因疗法是将目的基因以合适的载体导入到靶细胞中,修复相关的基因缺陷,达到治疗肿瘤的目的。本研究旨在构建一种受人端粒酶逆转录酶启动子(human telomerase catalytic subunit,hTERT)和 zeste 增强子同源物 2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)(以下简称EZH2-shRNA)双调控的条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAds,以下简称腺病毒),通过靶向抑制 CRPC细胞增殖及侵袭能力,从而实现安全、高效、稳定治疗CRPC的目的,为CRPC的精准基因治疗提供实验基础。目的:检测人前列腺组织中EZH2蛋白的表达水平。通过构建由hTERT和EZH2-shRNA双调控的腺病毒,探讨腺病毒对CRPC细胞增殖及侵袭能力的影响,为CRPC的精准基因治疗提供实验基础。方法:获取CRPC、良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)、HSPC患者的前列腺组织样本,采用免疫组织化学方法检测3组样本中EZH2蛋白的表达水平。构建一种由hTERT和EZH2-shRNA双调控的腺病毒,设计两条shRNA(即3hRNA1、shRNA2),用增殖实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测含两种不同shRNA的腺病毒对PC-3细胞增殖能力的干扰效果,筛选出干扰效果较好的shRNA进行后续实验。使用干扰效果较好的腺病毒去转染人肺腺癌A549细胞,通过镜下观察细胞被转染后的荧光图像,观察腺病毒是否构建成功。使用筛选出的腺病毒去转染PCa细胞(PC-3及DU145)。CCK-8实验及侵袭实验(Transwell)检测腺病毒转染前后PC-3和DU145细胞的增殖和侵袭能力。Western blot实验来检测腺病毒转染前后PC-3与DU145细胞中EZH2、CCND1、Ki-67及E-cadherin蛋白的表达。结果:1.免疫组化方法检测显示:与BPH患者标本相比,EZH2蛋白在HSPC和CRPC患者标本中表达明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,在不同类型的PCa标本中(CRPC与HSPC),对EZH2蛋白的表达量进行评分,EZH2评分较低部分中HSPC占比较大,而EZH2评分较高部分中则CRPC占比较大。两组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.基因测序证明单克隆抗体中shRNA及hTERT序列的正确性,表明单克隆载体构建成功。CCK-8法检测shRNA1和shRNA2对PC-3细胞增殖的干扰效果,结果显示,shRNA2抑制PC-3细胞增殖的效率更高。同时,我们使用携带EZH2-shRNA2及hTERT基因的腺病毒去干扰A549细胞,24 h、48 h、72 h后的荧光分析显示转染的细胞随时间逐渐增加,间接表明我们成功构建了腺病毒载体。3.Transwell侵袭实验结果表明,实验组(经腺病毒转染的细胞组)培养48 h后可显着抑制PCa细胞(PC-3和DU145)的侵袭能力,表明腺病毒对PCa细胞的侵袭能力具有显着抑制作用。实验组与对照组(未经腺病毒转染的细胞组)相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.CCK-8结果显示,在PC-3及DU145细胞中,与未经转染的细胞相比,腺病毒转染PCa细胞后能显着抑制细胞的增殖能力(P<0.05)。5.Western blot结果显示,当EZH2蛋白的表达被抑制时,Ki-67及CCND1的表达也相应下降。相反,E-cadherin的表达增加。结论:1.EZH2蛋白在人前列腺癌组织中表达水平增高,且CRPC组织中EZH2蛋白较HSPC中表达上调明显。2.比较免疫组化检测中EZH2蛋白强度评分,EZH2蛋白在HSPC与CRPC组织中表达差异明显。3.成功的构建了能够在PCa细胞中稳定表达的CRAds。4.hTERT及EZH2-shRNA双调控的CRAds能够抑制人PCa细胞的增殖及侵袭能力,表现出显着的抗肿瘤作用。5.EZH2蛋白表达水平下调引起Ki-67、CCND1蛋白表达水平下调,同时E-cadherin蛋白表达水平上调。(本文来源于《扬州大学》期刊2019-04-05）
陈皓[2]（2017）在《间充质干细胞装载病毒复制受Tet-on调控的条件复制型腺病毒在乳腺癌荷瘤鼠模型中的治疗研究》一文中研究指出肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。尽管传统治疗手段应用广泛,但因为缺乏肿瘤特异性,常会对正常细胞造成较大的毒副作用。经过基因工程改造的溶瘤腺病毒因其能够在肿瘤细胞中特异性扩增,故称为条件复制型腺病毒。尽管经过优化和改进的溶瘤腺病毒已经用于临床治疗,但依然存在一些缺点,如免疫原性高,肝脏毒性大,瘤内注射时病毒感染肿瘤的范围有限以及腺病毒复制的安全性问题等。克服上述溶瘤腺病毒缺点的一个方法是使用间充质干细胞来装载和投送腺病毒载体。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类非造血系统来源的成体多能干细胞,它可以从骨髓,脂肪组织,外周血,脐带血,骨,肌肉,软骨等多种组织中分离得到。在肿瘤基因治疗中,MSC因具有归巢性和免疫逃避等特点,常被用来作为投送治疗基因或者病毒载体的工具。当使用MSC作为溶瘤腺病毒的投送载体时,由于溶瘤腺病毒可以在MSC中进行复制,因此导致MSC的活力降低,如迁移与归巢的活力降低,最终影响MSC投送病毒的能力及基因治疗效果。所以使用MSC投送溶瘤腺病毒时,MSC的病毒装载量不能过大,需要与MSC的归巢活力保持平衡,即在不影响MSC迁移和归巢活力的情况下尽量增大病毒装载量,以获得最佳的基因治疗效果。构建一种病毒复制可以被调控的溶瘤腺病毒是解决这种平衡问题的关键。实施对溶瘤腺病毒复制的调控,可以控制病毒在MSC未到达肿瘤细胞之前不在细胞内复制,当MSC迁移到肿瘤组织后,再使病毒复制开启,这样可以在不影响MSC活力的情况下,获得最大的病毒装载量。该种方式可以精确控制病毒的释放,确保在MSC到达肿瘤组织之后释放病毒,进而避免病毒对正常组织和细胞的影响。使用MSC投送调控复制溶瘤腺病毒进行体内肿瘤治疗,可利用了 MSC的归巢和免疫逃避的优势,将病毒更加安全有效地投送至肿瘤组织区域,从而实现溶瘤腺病毒对肿瘤治疗安全性和有效性。实施对目的基因的表达调控,可以使人们对基因功能的研究和基于基因的疾病治疗变得更为细致精准。Tet调控系统因其安全有效被广泛地使用在基因功能研究和基因治疗领域。利用Tet调控系统调控溶瘤腺病毒在MSC中的复制,是控制腺病毒复制的一个有效策略。腺病毒的复制起始于病毒E1A基因的表达,若能使用Tet-on系统调控病毒E1A基因表达,就可以实现对MSC中溶瘤腺病毒复制的调控,该策略将对MSC装载溶瘤腺病毒的肿瘤基因治疗奠定重要基础。因此本研究基于以上的研究背景,从肿瘤治疗的安全性和有效性意义出发,构建一种病毒复制受Tet-on调控的条件复制型腺病毒,并在体外测试该病毒的基础上,评估其在乳腺癌动物模型体内的治疗效果。为了完成上述的目标,本课题进行了实验研究并取得了以下结果。(1)病毒复制受rtTA介导的转录激活型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体的构建与测试:本研究构建了 3种rtTA介导的Tet-on系统,并构建了使用此3种Tet-on系统调控病毒ElA基因表达的病毒载体,包装成病毒后在细胞内进行病毒的复制检测。研究结果显示,3种rtTA介导的Tet-on系统无法有效调控病毒复制。采用Luciferase报告基因对失控原因进行探索分析,结果显示,rtTA介导的激活型Tet-on系统调控病毒ElA基因表达时,会受到ElA基因自身蛋白产物及腺病毒的某种组份的干扰,导致病毒复制调控失效。研究证实激活型Tet-on系统控制病毒复制的策略可行性较差。(2)病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体的构建与测试:构建了 TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控系统,及由该系统调控复制的条件复制型腺病毒载体,检测了病毒在细胞内的复制及hMSC装载病毒实验。研究结果显示,此类型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒在肿瘤细胞及hMSC内复制可以得到有效调控,关闭该病毒在hMSC中的复制,可以将hMSC对腺病毒装载量提升一个数量级。(3)hMSC装载病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的腺病毒在乳腺癌MDA-MB-231荷瘤模型中的治疗研究:使用上述有效的复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒感染hMSC,利用hMSC投送该病毒对乳腺癌荷瘤裸鼠模型进行了体内治疗研究。研究结果显示,装载该病毒的hMSC可以有效抑制肿瘤生长,并且抑制效果受到Dox的精确调控。综上所述,本研究对不同类型的Tet-on系统调控腺病毒的复制进行了研究探索。提出了病毒复制受rtTA介导的激活型Tet-on系统调控的条件复制腺病毒复制失控的原因;首次构建了病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒载体,证实该病毒在肿瘤细胞及hMSC内复制可以得到有效调控,可以将hMSC对病毒装载量提升一个数量级;首次利用hMSC装载病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒对乳腺癌细胞荷瘤裸鼠模型进行了体内治疗,结果显示装载该病毒的hMSC可以有效抑制肿瘤生长,并且抑制效果受到Dox的精确调控。(本文来源于《陕西师范大学》期刊2017-05-01）
李龙光,李书华,王红艳,龙捷,谢晓斌[3]（2015）在《CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用》一文中研究指出目的:构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP,探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法:PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒p DC316-GFP,将骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre和重组质粒p DC316-CXCR4-GFP共转染293细胞,产生重组腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并扩增,扩增后进行PCR鉴定和腺病毒滴度测定;real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达,筛选出表达最高的A549细胞;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞,检测两者转染后CXCR4启动子活性和腺病毒复制数;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞和16HBE细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,CCK-8检测各组细胞活性。结果:成功构建重组质粒p DC316-CXCR4-GFP,与骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre共转染293细胞后第11天可见片状绿色荧光;PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重组腺病毒基因组中;测定重组腺病毒滴度为1×1013PFU/L;CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后E1A的mRNA和E4表达较Ad-NULL组明显上升;与Ad-NULL组和空白对照组相比,CRAd-CXCR4-GFP组前4 d A549细胞凋亡率和活性无明显差异,第5天细胞凋亡率明显增加,细胞活性明显降低,各组间5 d内16HBE细胞的细胞凋亡率和细胞活性均无明显变化。结论:成功构建条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP,该载体对肺癌细胞具有靶向杀伤作用。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2015年07期）
陈亚平,姜晓晓,冯守信,蒋冠[4]（2015）在《条件复制腺病毒携带白细胞介素24增强Hela细胞放射敏感性》一文中研究指出目的:观察条件复制性腺病毒(ZD55)携带白介素24(ZD55-IL-24)单独与联合放射治疗对宫颈癌Hela细胞的治疗效果。方法:体外培养宫颈癌Hela细胞,分成PBS组、放射治疗组、ZD55-IL-24组、ZD55-IL-24联合放射治疗组。采用MTT法检测细胞生长抑制率,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,流式细胞仪检测细胞活性氧ROS水平,Western blot检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达。结果:MTT法显示PBS组、放射治疗组、ZD55-IL-24组、ZD55-IL-24联合放射治疗组抑制率分别为(7.28±1.99)%、(45.16±4.12)%、(33.23±2.63)%、(85.27±2.03)%,ZD55-IL-24联合放射治疗组细胞抑制率大于其他叁组(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI双染法显示ZD55-IL-24联合放射治疗组细胞凋亡率为(72.82±4.57)%,与PBS组(7.40±0.74)%,放射治疗组(33.60±3.27)%,ZD55-IL-24组(24.66±5.36)%相比,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测PBS组、放射治疗组、ZD55-IL-24组、ZD55-IL-24联合放射治疗组细胞ROS率分别为(8.37±1.27)%、(27.97±2.22)%、(21.60±1.12)%、(43.57±2.61)%,ZD55-IL-24联合放射治疗组与其他叁组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示ZD55-IL-24联合放射治疗组Bax蛋白表达明显增加,Bcl-2蛋白明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:条件复制性腺病毒携带白介素24可增强宫颈癌Hela细胞放射敏感性。(本文来源于《现代肿瘤医学》期刊2015年09期）
王宏芳,吴嘉慧,刘纯岩,刘威武,孙延红[5]（2014）在《携带TRAIL基因的条件复制型腺病毒载体的构建及其辐射诱导表达》一文中研究指出目的:构建携带早期生长反应基因-1(Egr-1)启动子和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的条件复制型腺病毒载体pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,观察其联合2.0Gy X射线照射对人乳腺癌MDA-MB-231细胞TRAIL表达的影响。方法:以pMD18T-Egr1为模板,成功克隆Egr-1序列,将TRAIL基因置于下游,构建条件复制型腺病毒载体pShuttle-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1BpE1B55K(CRAd.pEgr1-TRAIL),病毒包装后感染细胞,给予X线照射,利用Real time PCR法检测TRAIL mRNA表达水平,ELISA法检测TRAIL蛋白表达水平。实验设对照(control)组、2Gy组、空病毒(CRAd.p)组、CRAd.p+2Gy组、CRAd.p-Egr1-TRAIL组和CRAd.p-Egr1-TRAIL+2Gy组。结果:成功构建pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,并进行了病毒包装。以病毒滴度5感染复数(MOI)感染MDA-MB-231细胞24h后给予2.0Gy X射线照射,4h后MDA-MB-231各组细胞中TRAIL mRNA表达水平开始升高,8h后各组表达达峰值;CRAd.pEgr1-TRAIL+2.0Gy组mRNA表达水平升高最为明显,约为对照组的160倍(P<0.01),随后表达水平逐渐下降;6h后各组MDA-MB-231细胞中TRAIL蛋白表达水平开始升高,24h后各组TRAIL蛋白表达水平达峰值,48h后TRAIL蛋白表达水平下降,但仍未降至正常水平;与其他各组比较,CRAd.pEgr1-TRAIL+2.0Gy组TRAIL蛋白表达水平升高最明显(P<0.01)。结论:成功获得条件复制型腺病毒载体,联合2.0Gy X射线照射可使MDA-MB-231细胞中TRAIL mRNA和蛋白表达水平升高。(本文来源于《吉林大学学报(医学版)》期刊2014年04期）
陈文庆,金新天,闫松,刘刚,王巍[6]（2014）在《HRE和hTERT修饰条件复制型腺病毒携带Egr-1介导的Smac对人食管癌细胞Eca109周期和凋亡的影响》一文中研究指出目的探讨以HRE和hTERT修饰条件复制型腺病毒携带Egr-1介导的Smac(CARd.pE-Smac)对人食管癌细胞Eca109周期和凋亡的影响。方法利用氯化钴进行化学乏氧,病毒感染滴度为5MOI[Multiplicity of infection(virus/cell)]感染人食管癌Eca109细胞24h,并进行2Gy照射,12h后分别利用Western blotting检测Smac蛋白的表达,PI染色和AnnexinⅤ-FITC双染,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化。实验分为control、CARd.pESmac、hypoxia、2Gy、H+CARd.pE-Smac、CARd.pE-Smac+2Gy和H+CARd.pE-Smac+2Gy组。结果 CARd.pE-Smac感染常氧和乏氧的Eca109细胞后均未见Smac蛋白表达增加,而2Gy照射后,常氧、感染CARd.pE-Smac和乏氧再感染CARd.pE-Smac均能使Smac蛋白表达增加,尤其以叁者联用后Smac表达增加最大;感染CARd.pESmac未对细胞周期有明显改变,而乏氧、2Gy和感染CARd.pE-Smac任二者(乏氧与2Gy除外)或者叁者联用均能显着增加S期和G2/M期细胞百分比增加(P<0.05,P<0.01),尤其以叁者联用作用更强;而且,对于细胞凋亡的诱导作用与周期进程变化的规律相类似。结论 HRE和hTERT修饰条件复制型腺病毒携带Egr-1介导的Smac在人食管癌细胞Eca109中显着过表达,且能够导致细胞发生S期延迟和G2/M期阻滞,并诱导细胞发生凋亡。(本文来源于《中国实验诊断学》期刊2014年07期）
李龙光[7]（2014）在《CXCR4启动的条件复制型腺病毒联合DAL-1转染人羊水干细胞对肺癌的治疗作用》一文中研究指出研究背景与目的肺癌是当今世界上发病率最高的恶性肿瘤，其最主要的致死原因是肿瘤的远处转移。DAL-1是一个抑癌基因，我们在前期试验中证明了DAL-1基因参与肺癌的增殖和转移过程的调控，由此提示DAL-1可作为肺癌的治疗靶点。腺病毒载体是最常用的基因治疗载体，在临床应用中其面临两大瓶颈：免疫原性强和缺乏靶向性。鉴于其靶向性差，学者提出条件复制性腺病毒的概念。条件复制性腺病毒能够选择性地在肿瘤细胞中完成感染和复制周期，从而特异性溶解肿瘤细胞，却不伤及正常组织。条件复制性腺病毒目前最需解决的问题是，如何提高驱动腺病毒复制的启动子的肿瘤靶向性。CXCR4是趋化因子SDF-1的特异性受体，研究指出CXCR4在超过20种不同类型肿瘤中有表达，而在非肿瘤组织中几乎不表达，另外CXCR4启动子也被证实了在肝脏中的低毒性，因此CXCR4启动子是较理想的肿瘤特异性启动子。间充质来源干细胞已被证实具有免疫原性低的特性和肿瘤归巢能力。人羊水干细胞属于间充质来源干细胞的一种，其取材安全、不涉及伦理道德问题和无成瘤性，有望成为理想的干细胞种子来源，人羊水干细胞现主要应用与再生领域，然而关于利用人羊水干细胞治疗恶性肿瘤的研究却鲜有报道。综上所述，为增强条件复制性腺病毒的靶向性和杀伤力，本研究拟构建一个新的载体Ad-CXCR4-DAL-1并转染人羊水干细胞。利用CXCR4启动子能特异性使腺病毒在靶细胞内复制并溶解靶细胞，DAL-1能特异性抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡，人羊水干细胞具有免疫原性低和肿瘤归巢的特性，旨在通过构建的特异性双靶向溶瘤病毒载体，降低腺病毒对非靶器官的毒副作用，联合抑癌基因以提高对肿瘤细胞的杀伤效应，利用人羊水干细胞携带Ad-CXCR4-DAL-1以降低腺病毒免疫原性，定点归巢于肿瘤局部，从而提高对肿瘤的靶向杀伤效应，为基因治疗提供一种新的策略。方法一、条件复制型腺病毒载体Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP的构建：构建重组质粒pAdxsi-CXCR4-DAL-1和pAdxsi-CXCR4-GFP，利用293细胞包装成条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP；TCID50法测定Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP滴度。二、CXCR4在A549细胞内启动活性的检测、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1转染A549细胞后复制数和DAL-1表达的检测：荧光定量PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4mRNA表达，筛选出表达最高的A549细胞；将构建的Ad-CXCR4-DAL-1（实验组）、Ad-CXCR4-GFP（对照组）和Ad-NULL（空载体组）分别转染至A549细胞中，荧光定量PCR检测各组E1AmRNA、E4DNA和DAL-1mRNA表达；Western Blot检测各组DAL-1蛋白的表达。叁、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1功能的检测：实验分四组：实验组、对照组、空载体组和空白对照组。流式细胞仪检测各组分别转染A549细胞和16HBE细胞后的凋亡率；CCK-8实验检测各组分别转染A549细胞和16HBE细胞后的细胞毒性，计算各组细胞活性率。四、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1体内抑瘤作用的检测：实验分叁组：实验组、空载体组和PBS组。2*106个A549细胞重悬于200μLPBS，注射至裸鼠皮下，建立裸鼠A549细胞移植瘤模型。瘤内注射各组病毒，每隔1天注射1次，每次每只1*109PFU，共4次。观察各组肿瘤生长速度和肿瘤体积；末次注射后的第21天处死全部裸鼠，分别称取各组裸鼠肿瘤重量，各组均取出肿瘤、肝脏和肺脏，荧光定量PCR检测各组肿瘤、肝脏和肺脏中E4DNA和DAL-1mRNA表达。五、人羊水干细胞的分离与鉴定：采用贴壁法分离培养人羊水干细胞；对第2代人羊水干细胞进行核型分析；流式细胞仪检测第2代人羊水干细胞表面抗原分子的表达；CCK-8实验检测第2代人羊水干细胞的增殖情况，连续检测5天，根据吸光度（OD）值描绘生长曲线。六、携带条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1的人羊水干细胞对肺癌作用的检测：将人羊水干细胞转染Ad-CXCR4-DAL-1（实验组）和Ad-NULL（空载体组），并设单纯人羊水干细胞组（hAFS组）和PBS组为对照。2*106个A549细胞重悬于200μLPBS，注射至裸鼠皮下，建立裸鼠A549细胞移植瘤模型。分别将各组进行瘤内和尾静脉注射至裸鼠A549细胞移植瘤模型中，观察每组肿瘤生长速度和肿瘤体积；经尾静脉注射后第7天每组取出1只裸鼠，利用活体成像系统观察人羊水干细胞肿瘤归巢能力；末次注射后的第21天处死全部裸鼠，分别称取各组裸鼠肿瘤重量，经瘤内注射的裸鼠处死后取出肿瘤、肝脏和肺脏，荧光定量PCR检测各组所取器官E4DNA和DAL-1mRNA表达。经尾静脉注射的裸鼠处死后取出肿瘤、肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、睾丸、小肠，荧光定量PCR检测各组所取器官E4DNA和DAL-1mRNA表达。结果一、重组质粒pAdxsi-CXCR4-DAL-1和pAdxsi-CXCR4-GFP经PCR鉴定分别显示1301bp、3204bp两条带和1301bp条带，证实插入片段大小与预期一致，测序结果显示扩增的目的片段序列与GenBank提供序列完全匹配，转染293细胞后包装出条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP，滴度测定分别为2*1011PFU/mL和1*1010PFU/mL。条件复制型腺病毒载体Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP成功构建。二、各组转染A549细胞后，荧光定量PCR及Western Blot检测结果显示：实验组和对照组的E1AmRNA和E4DNA表达较空载体组明显上升（P<0.01）；实验组和对照组的E1A mRNA和E4DNA表达比较无明显差异（P>0.05）；实验组DAL-1mRNA表达和DAL-1蛋白表达较对照组和空载体组明显上升（P<0.01）。实验证明CXCR4在A549细胞内有较高的启动活性；条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1转染A549细胞后有较高的复制数和DAL-1表达。叁、各组分别转染至A549细胞和16HBE细胞后，流式细胞仪检测显示，与空载体组和空白对照组相比，对照组前4天细胞凋亡率无明显差异（P>0.05），第5天凋亡率明显增加（P<0.01）；CCK-8毒性实验显示，对照组前4天细胞活性率无明显差异（P>0.05），第5天活性率明显降低（P<0.01）；流式细胞仪与CCK-8-检测显示各组间5天内16HBE的凋亡率和细胞活性率均无明显差异（P>0.05）；与对照组相比，实验组前3天细胞凋亡率和细胞活性率无明显差异（P>0.05），第4天凋亡率增加（P<0.01），细胞活性率降低（P<0.01），第5天凋亡率明显增加（P<0.01），细胞活性率明显降低（P<0.01）。体外实验证明CXCR4启动的条件复制型腺病毒对肺癌具有靶向溶瘤作用；DAL-1促进细胞凋亡，增强了Ad-CXCR4-DAL-1对肺癌的杀伤能力。四、裸鼠瘤内注射各组病毒后，实验组与空载体组、PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较差异明显（P<0.01）；空载体组与PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较无明显差异（P>0.05）；荧光定量PCR显示，实验组E4DNA和DAL-1mRNA表达较空载体组与PBS组明显增加（P<0.01）；各组肝脏和肺脏均无E4DNA和DAL-1mRNA表达。体内实验证明条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1能够抑制肺癌的生长，且对机体无产生毒性。五、人羊水干细胞原代培养贴壁后，呈集落式生长，可见上皮样及成纤维样两种集落，细胞传代后生长迅速，传至第2代后生长速度及形态均无明显改变；第2代人羊水干细胞核型分析是46（X，Y），为人正常二倍体核型；第2代人羊水干细胞表达间充质来源干细胞的标志CD29、CD44、CD90和CD105，而造血干细胞表面标志CD45、CD34则呈阴性表达；第2代人羊水干细胞增长迅速，细胞倍增时间约为24h。实验证明人羊水干细胞分离与鉴定成功。六、裸鼠注射各组病毒后，经瘤内注射的裸鼠，实验组与空载体组、hAFS组、PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较差异明显(P<0.05)；空载体组、hAFS组和PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较无明显差异（P>0.05）；荧光定量PCR显示，实验组E4DNA和DAL-1mRNA表达较空载体组、hAFS组和PBS组明显上升（P<0.01）。各组肝脏和肺脏均无E4DNA和DAL-1mRNA表达。实验证明条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1能在人羊水干细胞内高效复制和释放，并能发挥抑瘤作用。七、经尾静脉注射的裸鼠，活体成像系统检测显示，实验组、空载体组和hAFS组裸鼠经尾静脉注射7d后，在肿瘤周边出现荧光信号， PBS组肿瘤无荧光信号；实验组、空载体组和hAFS组总光子数较PBS组有明显差异（P<0.01），实验组、空载体组和hAFS组总光子数比较无明显差异（P>0.05），证明人羊水干细胞具有肺癌归巢能力。实验组、空载体组、hAFS组和PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较无明显差异(P>0.05)，但有减少趋势；空载体组、hAFS组和PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较无明显差异（P>0.05）；荧光定量PCR显示，实验组E4DNA和DAL-1mRNA表达较空载体组、hAFS组和PBS组上升（P<0.05）。各组所取器官均无E4DNA和DAL-1mRNA表达。实验证明携带条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1的人羊水干细胞能够提高肺癌靶向性，降低腺病毒免疫原性，对肺癌具有杀伤作用。结论一、成功构建条件复制型腺病毒载体Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP。二、CXCR4启动的条件复制型腺病毒对肺癌具有靶向溶瘤作用；DAL-1促进细胞凋亡，增强了条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1对肺癌的杀伤能力。叁、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1在体内能够抑制肺癌的生长。四、人羊水干细胞具有肺癌归巢能力，携带条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1的人羊水干细胞能够提高肺癌靶向性，降低腺病毒免疫原性，对肺癌具有杀伤作用。(本文来源于《广州医科大学》期刊2014-06-30）
张明,刘会宁,高献书,李红振,刘斌[8]（2013）在《条件复制型腺病毒联合丝裂霉素对膀胱癌细胞生长的抑制作用》一文中研究指出目的:探讨以中期因子(midkine,MK)基因为启动子的条件复制型溶瘤腺病毒(conditionally replicating oncolytic adenoviruses)Ad-MK单独或联合丝裂霉素(mitomycin,MMC)对膀胱移行细胞癌EJ细胞增殖的影响及可能的作用机制。方法:采用RT-PCR法检测EJ细胞中MKmRNA及感染Ad-MK后腺病毒E1amRNA的表达情况。MTT法检测Ad-MK和MMC单独或联合作用对膀胱癌细胞存活率的影响;光学显微镜下观察二者单独作用对EJ细胞形态的影响。通过测定病毒复制量观察MMC对Ad-MK复制的影响。建立膀胱移行细胞癌EJ细胞小鼠移植瘤模型,并观察Ad-MK单独或联合MMC对小鼠移植瘤生长的影响。结果:EJ细胞中可见MKmRNA的表达,感染Ad-MK后EJ细胞中可检测到腺病毒E1amRNA的表达。Ad-MK对膀胱癌细胞的增殖抑制作用呈明显的时间及剂量依赖性。Ad-MK联合低剂量MMC对EJ细胞生长的抑制作用明显增加,二者联合有协同作用。病毒复制量的测定发现,低剂量MMC能增加Ad-MK病毒在细胞中的复制作用,与单独感染病毒Ad-MK组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。小鼠体内实验证明,Ad-MK联合MMC治疗组小鼠的肿瘤生长缓慢,与单独感染病毒组比较,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。结论:Ad-MK可在膀胱移行癌细胞中复制,MMC与Ad-MK联合作用具有协同效应,能上调病毒在细胞中的复制能力,从而增强对膀胱移行癌细胞的抑制作用。(本文来源于《肿瘤》期刊2013年07期）
詹以安[9]（2013）在《CXCR4启动子调控的条件复制型腺病毒抗前列腺癌细胞的实验研究》一文中研究指出前列腺癌是西方国家常见的恶性肿瘤,我国前列腺癌的发病率虽比西方国家低,但随着人们生活水平的提高及生活习惯的改变,近年来前列腺癌发病率呈不断上升趋势,成为影响我国老年男性生活质量及预期寿命的重大疾病。在前列腺癌治疗中,尽管大部分前列腺癌在早期治疗中疗效显着,但是部分表现出较强的侵袭性、易复发甚至出现转移,内分泌治疗晚期几乎都出现激素抵抗,治疗这些前列腺癌使用现有的治疗方式往往会显得捉襟见肘。近年来,随着分子生物学研究的进展,基因治疗逐渐成为肿瘤学研究的热点,呈现出良好的应用前景。如何使得基因治疗对肿瘤的选择性强,对正常细胞干扰小,对晚期肿瘤或转移瘤灶仍有效等理念,越来越受到人们的重视。目前,具有在特定肿瘤细胞中条件性增殖复制并最终裂解肿瘤细胞的条件型溶瘤腺病毒,引起了人们极大关注,溶瘤病毒用于肿瘤治疗的研究发展非常迅速。溶瘤病毒不但自身在肿瘤细胞内复制导致细胞溶解和死亡,而且通过受感染的细胞释放出更多的病毒颗粒,产生一种级联放大效应,直至肿瘤细胞被清除。目前已可利用基因工程手段使溶瘤效应更加具有特异性和条件性,溶瘤腺病毒可以针对不同肿瘤加载其肿瘤特异性启动子,使得溶瘤病毒仅在特异的肿瘤组织中保持高活性,发挥溶解肿瘤细胞的功效。趋化因子受体CXCR4是近年来肿瘤研究领域中的热点,趋化因子受体CXCR4属于趋化因子受体家族,是一个具有352个氨基酸且高度保守受体蛋白,为七次跨膜的G蛋白偶联膜受体,已被证实在多种肿瘤细胞中高度特异性表达。目前,已有研究证实CXCR4启动子在肾癌和神经胶质瘤中呈现肿瘤特异性,这提示CXCR4启动子极有可能成为前列腺癌基因治疗中肿瘤特异性启动子的候选者。因此,本研究重点评价并比较CXCR4启动子调控的条件复制性腺病毒Ad-CXCR4-E1对前列腺癌细胞生长抑制的情况,分为如下部分：第一部分CXCR4在前列腺癌细胞与前列腺上皮细胞中的表达差异目的：观察趋化因子受体CXCR4在前列腺癌细胞LNCaP、PC-3、前列腺上皮细胞RWPE-1中的表达,探讨趋化因子受体CXCR4在癌细胞和正常细胞系的表达差异。方法：常规培养前列腺癌细胞LNCaP、PC-3、前列腺上皮细胞RWPE-1,通过采用半定量RT-PCR法检测LNCaP、PC-3、RWPE-1中CXCR4基因在转录水平上的表达情况,Western blot印迹检测CXCR4在LNCaP、PC-3、RWPE-1细胞中转录后水平的表达情况。结果：叁种细胞中都可以检测到CXCR4的表达,但在前列腺癌细胞中,CXCR4存在高水平的表达(p<0.01)。对于前列腺癌各细胞之间,CXCR4的表达水平为LNCaP>PC-3(P<0.05)。结论：通过叁种细胞系的比较,前列腺癌细胞LNCaP及PC-3中存在CXCR4高表达,提示前列腺癌细胞中存在CXCR4特异性高表达。第二部分CXCR4启动子的克隆及其在前列腺癌细胞中转录特异性分析目的：评估CXCR4启动子在前列腺癌细胞中的特异转录活性。方法：采用PCR方法扩增CXCR4启动子序列,将其克隆到含有报告基因红色荧光蛋白的质粒载体pDsRed2-1和含有荧光素酶(LUC2)的质粒载体pGL4.17,经脂质体分别转染前列腺癌细胞LNCaP、PC-3和前列腺上皮细胞RWPE-1。荧光显微镜下观察DsRed2的表达情况,并测定CXCR4启动子在叁种细胞中的荧光素酶活性。结果：CXCR4启动子仅在前列腺癌细胞中表现出特异的转录活性,其中LNCaP中启动子活性高于PC-3(P<0.05)。前列腺上皮细胞RWPE-1中几乎观测不到DsRed2的表达。荧光素酶活性表明CXCR4启动子在前列腺癌细胞中的活性远高于前列腺上皮细胞(P<0.001)。结论：CXCR4启动子在前列腺癌细胞中具有较强的特异转录活性,提示CXCR4启动子可以作为前列腺癌基因靶向治疗的“特异开关”。第叁部分CXCR4调控的条件复制型腺病毒对人前列腺癌细胞特异性杀伤作用目的：用CXCR4调控的条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-E1感染人前列腺癌细胞LNCaP, PC-3及人正常前列腺上皮细胞RWPE-1,通过检测细胞存活率评价条件复制性腺病毒对于前列腺癌细胞的特异性杀伤。方法：采用RT-PCR法从人胚肾293细胞(HEK293)中扩增条件复制型腺病毒必需的E1区基因,构建含有CXCR4启动子的条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-E1,感染人前列腺癌细胞LNCaP, PC-3和正常前列腺上皮细胞RWPE-1。Western blot检测感染后细胞E1蛋白的表达。感染后行细胞病变试验、台盼蓝染色、MTT、结晶紫染色法及流式细胞学检测,评估重组腺病毒对前列腺癌细胞生长及杀伤的影响。结果：质粒酶切鉴定及PCR结果证实成功构建了含有CXCR4启动子和E1区基因的条件复制型腺病毒载体Ad-CXCR4-E1, Western blot结果显示感染Ad-CXCR4-E1后在高表达CXCR4的前列腺癌细胞中E1表达明显增高,而在正常前列腺上皮细胞中,不能检测到E1的表达。细胞病变试验、台盼蓝染色、MTT、结晶紫染色法及流式细胞术结果表明Ad-CXCR4-E1病毒对前列腺癌细胞有明显的杀伤作用(P<0.05),对正常前列腺上皮细胞没有显着的杀伤作用(P>0.05)。结论：成功构建了CXCR4启动子调控的条件复制型腺病毒,该病毒对前列腺癌细胞有显着的杀伤作用,对正常细胞无明显影响,实验结果为前列腺癌细胞靶向治疗提供了更为良好的条件复制型病毒载体及新的治疗策略。(本文来源于《南昌大学》期刊2013-06-01）
王宏芳,刘扬,李金华,吴嘉慧,李艳博[10]（2013）在《双重靶向条件复制型腺病毒的包装及抗肿瘤作用》一文中研究指出目的构建并包装以人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子调控E1A(CR2区缺失)蛋白表达的肿瘤细胞双重靶向条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAd),并探讨其对肿瘤细胞的抑制作用。方法采用PCR技术扩增hTERT启动子序列,将其克隆至pShuttle-E1A-E1Bp-E1B55K载体(E1A基因CR2区缺失)中,构建重组腺病毒质粒,并转染HEK293细胞进行病毒包装,PCR鉴定;CCK-8法检测重组腺病毒(CRAd.p-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,简称CRAd.p)对肿瘤细胞的抑制作用。结果 hTERT启动子序列克隆正确;pShuttle-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K经KpnⅠ单酶切可见1 542bp和6 775bp两条电泳带,PCR鉴定得到250、1 148bp和298bp基因片段;CRAd.p经PCR扩增得到250、1 148bp和298bp基因片段,鉴定结果与预期完全相符;CRAd.p感染MCF-7、MDA-MB-231、HepG2和HTC-8细胞72h后与各自对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);CRAd.p感染MDA-MB-231细胞后10～250MOI组细胞吸光度值与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),随着感染时间延长,抑制作用越发明显。结论成功获得对肿瘤细胞具有双重靶向和溶瘤作用的条件复制型腺病毒,为基因治疗的靶向性和有效性提供了可能。(本文来源于《西安交通大学学报(医学版)》期刊2013年03期）
条件复制腺病毒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。尽管传统治疗手段应用广泛,但因为缺乏肿瘤特异性,常会对正常细胞造成较大的毒副作用。经过基因工程改造的溶瘤腺病毒因其能够在肿瘤细胞中特异性扩增,故称为条件复制型腺病毒。尽管经过优化和改进的溶瘤腺病毒已经用于临床治疗,但依然存在一些缺点,如免疫原性高,肝脏毒性大,瘤内注射时病毒感染肿瘤的范围有限以及腺病毒复制的安全性问题等。克服上述溶瘤腺病毒缺点的一个方法是使用间充质干细胞来装载和投送腺病毒载体。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类非造血系统来源的成体多能干细胞,它可以从骨髓,脂肪组织,外周血,脐带血,骨,肌肉,软骨等多种组织中分离得到。在肿瘤基因治疗中,MSC因具有归巢性和免疫逃避等特点,常被用来作为投送治疗基因或者病毒载体的工具。当使用MSC作为溶瘤腺病毒的投送载体时,由于溶瘤腺病毒可以在MSC中进行复制,因此导致MSC的活力降低,如迁移与归巢的活力降低,最终影响MSC投送病毒的能力及基因治疗效果。所以使用MSC投送溶瘤腺病毒时,MSC的病毒装载量不能过大,需要与MSC的归巢活力保持平衡,即在不影响MSC迁移和归巢活力的情况下尽量增大病毒装载量,以获得最佳的基因治疗效果。构建一种病毒复制可以被调控的溶瘤腺病毒是解决这种平衡问题的关键。实施对溶瘤腺病毒复制的调控,可以控制病毒在MSC未到达肿瘤细胞之前不在细胞内复制,当MSC迁移到肿瘤组织后,再使病毒复制开启,这样可以在不影响MSC活力的情况下,获得最大的病毒装载量。该种方式可以精确控制病毒的释放,确保在MSC到达肿瘤组织之后释放病毒,进而避免病毒对正常组织和细胞的影响。使用MSC投送调控复制溶瘤腺病毒进行体内肿瘤治疗,可利用了 MSC的归巢和免疫逃避的优势,将病毒更加安全有效地投送至肿瘤组织区域,从而实现溶瘤腺病毒对肿瘤治疗安全性和有效性。实施对目的基因的表达调控,可以使人们对基因功能的研究和基于基因的疾病治疗变得更为细致精准。Tet调控系统因其安全有效被广泛地使用在基因功能研究和基因治疗领域。利用Tet调控系统调控溶瘤腺病毒在MSC中的复制,是控制腺病毒复制的一个有效策略。腺病毒的复制起始于病毒E1A基因的表达,若能使用Tet-on系统调控病毒E1A基因表达,就可以实现对MSC中溶瘤腺病毒复制的调控,该策略将对MSC装载溶瘤腺病毒的肿瘤基因治疗奠定重要基础。因此本研究基于以上的研究背景,从肿瘤治疗的安全性和有效性意义出发,构建一种病毒复制受Tet-on调控的条件复制型腺病毒,并在体外测试该病毒的基础上,评估其在乳腺癌动物模型体内的治疗效果。为了完成上述的目标,本课题进行了实验研究并取得了以下结果。(1)病毒复制受rtTA介导的转录激活型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体的构建与测试:本研究构建了 3种rtTA介导的Tet-on系统,并构建了使用此3种Tet-on系统调控病毒ElA基因表达的病毒载体,包装成病毒后在细胞内进行病毒的复制检测。研究结果显示,3种rtTA介导的Tet-on系统无法有效调控病毒复制。采用Luciferase报告基因对失控原因进行探索分析,结果显示,rtTA介导的激活型Tet-on系统调控病毒ElA基因表达时,会受到ElA基因自身蛋白产物及腺病毒的某种组份的干扰,导致病毒复制调控失效。研究证实激活型Tet-on系统控制病毒复制的策略可行性较差。(2)病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体的构建与测试:构建了 TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控系统,及由该系统调控复制的条件复制型腺病毒载体,检测了病毒在细胞内的复制及hMSC装载病毒实验。研究结果显示,此类型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒在肿瘤细胞及hMSC内复制可以得到有效调控,关闭该病毒在hMSC中的复制,可以将hMSC对腺病毒装载量提升一个数量级。(3)hMSC装载病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的腺病毒在乳腺癌MDA-MB-231荷瘤模型中的治疗研究:使用上述有效的复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒感染hMSC,利用hMSC投送该病毒对乳腺癌荷瘤裸鼠模型进行了体内治疗研究。研究结果显示,装载该病毒的hMSC可以有效抑制肿瘤生长,并且抑制效果受到Dox的精确调控。综上所述,本研究对不同类型的Tet-on系统调控腺病毒的复制进行了研究探索。提出了病毒复制受rtTA介导的激活型Tet-on系统调控的条件复制腺病毒复制失控的原因;首次构建了病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒载体,证实该病毒在肿瘤细胞及hMSC内复制可以得到有效调控,可以将hMSC对病毒装载量提升一个数量级;首次利用hMSC装载病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒对乳腺癌细胞荷瘤裸鼠模型进行了体内治疗,结果显示装载该病毒的hMSC可以有效抑制肿瘤生长,并且抑制效果受到Dox的精确调控。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
条件复制腺病毒论文参考文献
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