导读:本文包含了增殖特性论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:细胞,病毒,黏膜,干细胞,特性,酵解,转染。
增殖特性论文文献综述
刘阿华,王毅,李言言,高洋,谷奎[1]（2019）在《羊口疮病毒在GT26细胞系中的增殖特性研究》一文中研究指出为了明确羊口疮病毒(ORFV)在GT26细胞系上的增殖特性,将ORFV分别接种于GT26细胞系、羊睾丸原代细胞(GTC)、牛睾丸原代细胞(BTC)和山羊胎儿皮肤成纤维细胞(GFFC)。比较上述细胞的细胞病变(CPE)特点并进行PCR检测和TCID_(50)测定,从而评估GT26增殖ORFV的效果。结果显示,ORFV能在GT26细胞上增殖,并能产生明显的CPE,接毒后36 h开始出现CPE,72h CPE更加明显;与其他3种原代细胞一样,在PCR检测中,接种了ORFV的GT26细胞裂解液中能扩增出540 bp的目的片段;ORFV在GT26细胞的TCID_(50)为10~(-6.5),而在BTC、GFFC和GTC细胞的TCID_(50)分别为10~(-6.7)、10~(-6.3)、10~(-7.0)。表明ORFV在GT26细胞上的滴度与上述3种原代细胞相当,GT26细胞能够用于大量增殖ORFV。(本文来源于《动物医学进展》期刊2019年10期）
宁婷婷[2]（2019）在《脂多糖对不同鼠龄牙髓干细胞增殖及矿化特性影响的实验研究》一文中研究指出研究背景牙髓干细胞是一群存在于牙髓组织中间充质来源的成体干细胞,具有高增殖活性、自我更新能力及多向分化潜能。在牙髓损伤修复过程中,可以分化为成牙本质细胞、成纤维细胞等功能细胞,维持局部组织的稳态平衡,在牙髓组织的损伤修复中发挥重要作用。然而,随着年龄的增长,组织干细胞的再生潜能下降。这可能与干细胞数目的减少、固有功能减弱及干细胞所处的微环境改变相关。当牙髓组织暴露于细菌的代谢产物时,可产生不同程度的炎症反应。炎症反应轻微时,牙髓干细胞可分化为成牙本质细胞,参与牙髓组织修复过程,炎症剧烈时可引起牙髓组织坏死。供体年龄作为影响细胞生存微环境的重要因素之一,对牙髓干细胞的增殖和分化具有一定的影响。然而,关于不同年龄供体来源的牙髓干细胞对炎症刺激的反应及修复的能力的差异目前相关报道甚少。故本实验拟采用细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激牙髓干细胞体外模拟炎症微环境,探究不同鼠龄牙髓干细胞在炎症状态下增殖及矿化等相关特性的差异,进一步探究年龄因素对牙髓干细胞受炎症刺激后修复再生能力的影响,为牙髓干细胞在牙髓损伤修复中的应用提供理论基础。材料与方法1.幼龄大鼠牙髓干细胞及成龄大鼠牙髓干细胞分离培养及鉴定采用改良组织块酶消化法从幼龄Sprague-Dawley大鼠及成龄Sprague-Dawley大鼠牙髓组织中分离纯化出牙髓干细胞,命名为幼龄鼠牙髓干细胞(juvenile rat dental pulp stem cells,JDPSCs)与成龄鼠牙髓干细胞(adult rat dental pulp stem cells,ADPSCs)。进行成脂、成骨/成牙本质向诱导分化,检测多向分化潜能;流式细胞术检测相关细胞表面标记物的表达。2.大鼠牙髓组织及牙髓干细胞增龄性变化两种鼠龄牙髓组织切片HE染色、牙髓干细胞及组织切片衰老相关(β-半乳糖苷酶(Senescence p-Galactosidase,SA-P-Gal)染色比较大鼠牙髓组织、牙髓干细胞增龄性变化;CCK8实验、流式细胞术比较JDPSCs和ADPSCs增殖能力。3.不同浓度LPS对JDPSCs和ADPSCs增殖及矿化的影响采用CCK8实验及流式细胞术检测LPS对JDPSCs和ADPSCs增殖能力的影响。在矿化诱导的条件下,采用茜素红染色、碱性磷酸酶染色、qRT-PCR及Western Blot等检测LPS对JDPSCs和ADPSCs成骨/成牙本质向分化的影响。结果1.JDPSCs和ADPSCs的生物学特性及牙髓组织的增龄性变化本实验成功从大鼠牙髓组织中分离纯化出JDPSCs和ADPSCs,两种细胞均可成骨/成牙本质向及成脂向分化,阳性表达间充质干细胞表面标分子记物CD90、CD29,阴性表达造血干细胞表面分子标记物CD45;从刺激的第1d起,在同一时间点下ADPSCs的增殖OD低于JDPSCs(P<0.01),ADPSCs处于S期的细胞比例显着低于JDPSCs(P<0.01);ADPSCs较JDPSCs有更高的SA-β-Gal表达水平(P<0.01);成龄鼠牙髓组织血管含量及组织SA-β-Gal表达较幼龄鼠的增多。2.JDPSCs和ADPSCs在LPS刺激下细胞增殖及矿化的变化CCK8结果显示LPS刺激浓度为0.1-1μg/mL时,从刺激的第1d至第5d,在同一时间点,JDPSCs受LPS刺激实验组较无LPS刺激对照组OD值显着升高,ADPSCs受LPS刺激实验组较对照组的OD值高(P<0.01),且在LPS刺激下JDPSCs组的增加趋势明显大于ADPSCs组;当LPS浓度为10 μg/mL或100 μg/mL时,JDPSCs及ADPSCs在刺激的早期(24 h),同一时间点下,实验组较无LPS刺激的对照组OD值明显升高(P<0.05),而随着刺激时间延长,实验组的OD值降低。在矿化诱导条件下,低浓度的LPS(<1 μg/mL)均能促进JDPSCs和ADPSCs矿化结节形成,JDPSCs增多趋势较ADPSCs明显;RT-PCR及Western Blot结果表明低浓度LPS促进JDPSCs和ADPSCs矿化相关基因(ALP、OCN、BSP、DSPP)及蛋白(ALP)的表达,且JDPSCs促进趋势明显高于ADPSCs。结论1.幼龄及成龄大鼠牙髓组织中可分离培养出牙髓干细胞,JDPSCs和ADPSCs均为间充质来源,具有多向分化潜能。JDPSCs比ADPSCs有较高增殖能力,较低的SA-p-Gal表达水平。2.低浓度LPS(0.1-1 μg/mL)促进JDPSCs及ADPSCs的增殖,并且对JDPSCs促进程度明显大于ADPSCs。较高浓度(10μg/mL或100μg/mL)LPS短时间(24 h)刺激可促进JDPSCs及ADPSCs的增殖,随着刺激时间的延长抑制增殖。3.低浓度的LPS(0.5 μg/mL)可以促进JDPSCs和ADPSCs矿化相关基因及蛋白的表达,及矿化结节的形成,LPS对JDPSCs成骨/成牙向分化的促进作用较ADPSCs明显,提示JDPSCs较ADPSCs在一定程度的炎症微环境中有更强的修复能力。(本文来源于《南方医科大学》期刊2019-06-21）
汤智慧,王津津,郭抗抗[3]（2019）在《端粒酶基因转染猪气管黏膜上皮细胞增殖特性的研究》一文中研究指出为了研究外源性端粒酶(hTERT)基因导入后对原代培养猪气管黏膜上皮细胞(STECs)增殖活性的影响,试验将外源性hTERT基因转染至原代分离培养的STECs中,以脂质体法用重组质粒pCI-neo-hTERT转染STECs;通过倒置显微镜观察细胞形态,间接免疫荧光法鉴定8型角蛋白的上皮源性;用PCR和Western-blot法检测转染后STECs中hTERT基因的表达情况;用MTT法和流式细胞仪分别检测转染细胞的活力和增殖周期。结果表明:脂质体和质粒体积比会影响转染效率,当二者比例为1∶3时,转染效率最佳;转染细胞经PCR扩增得到大小为461 bp的片段,Western-blot检测得到大小为125 ku的条带;转染后的细胞仍然符合上皮源性细胞的生长特点;细胞活力曲线显示,在接种后的第3～5天细胞增殖速度最快;细胞周期测定显示,转染细胞的细胞核型为2倍体,S期细胞达到48.35%。说明原代培养的STECs转染外源性hTERT基因后,细胞增殖活性增高,并保持了基本的细胞生物学特征,有进一步建立稳定传代细胞系的可能。(本文来源于《黑龙江畜牧兽医》期刊2019年11期）
崔红杰[4]（2019）在《永生化猪口腔黏膜上皮细胞系的建立及猪圆环病毒2型和口蹄疫病毒增殖特性的研究》一文中研究指出口腔黏膜上皮细胞是机体重要的屏障,但也是许多病毒和细菌入侵机体的主要靶标途径。正常组织细胞寿命有限。原代猪口腔黏膜上皮细胞(porcine oral mucosal epithelial cells,POMECs)通常在经过12次传代之后衰老死亡。永生化细胞系可为病毒相关疾病的研究提供良好的体外细胞模型。猪圆环病毒2(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus-associated diseases,PCADs)的主要病原,给国内外养猪业造成了巨大的经济损失。然而,目前还没有合适的细胞模型用于体外研究PCV2的致细胞病变效应(cytopathic effects,CPE),这严重制约了对PCV2致病机制的研究。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)侵袭易感动物(特别是猪、牛、羊等偶蹄家畜),以发热、黏膜或者皮肤(尤其是口腔和蹄叉部位)出现水疱为主要特征,但是因缺乏合适的动物细胞系,其致病机理的研究也受到了严重限制。本研究分离培养了原代POMECs,通过导入人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和G418抗性筛选获得了hTERT介导的永生化猪口腔黏膜上皮细胞系(hTERT-POMECs),同时在连续传代的过程中获得了一株自发永生化的猪口腔黏膜上皮细胞系(Spontaneous immortalized POMECs,Sp-POMECs),初步研究了PCV2或FMDV感染猪的口腔黏膜上皮细胞的基本特性,获得了以下研究结果。1.分离培养了仔猪口腔黏膜上皮细胞。比较组织块法、胰酶消化法、DispaseⅡ处理联合组织块法和DispaseⅡ处理联合胰酶消化法,发现DispaseⅡ处理联合组织块法是获得纯净POMECs的最优方法。形态学和间接免疫荧光试验表明所得到的POMECs具备典型的铺路石状上皮样细胞特征,表达角蛋白Pan-CK,不表达Vimentin。细胞增殖实验和细胞周期分析表明所得到的早期原代POMECs具有良好的增殖能力,但会随传代次数的增加迅速衰老。2.获得了永生化猪口腔黏膜上皮细胞系(hTERT-POMECs),已传代150代。用脂质体转染法将真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代POMECs中,通过G418抗性筛选获得了hTERT介导的永生化猪口腔黏膜上皮细胞系(hTERT-POMECs)。端粒酶活性检测及Western blot表明hTERT基因成功导入了原代POMECs。细胞增殖实验和细胞周期分析表明hTERT使得POMECs细胞具有了连续良好分裂增殖的能力。间接免疫荧光试验表明hTERT-POMECs具有复层鳞状上皮细胞的分子特征,表达角蛋白Pan-CK、CK14和CK13,不表达CK18和Vimentin。核型分析表明第100代hTERT-POMECs的核型为2n=38,由一对性染色体(X,Y)和18对常染色体组成,符合家猪染色体核型分类标准,无染色体异常。裸鼠致瘤试验表明第80代hTERT-POMECs不具有致瘤性。3.获得一株自发永生化的猪口腔黏膜上皮细胞系(Sp-POMECs),已传代150代。连续传代的原代POMECs突破了Hayflick界限,发生了自发永生化。形态学、细胞增殖实验、细胞周期分析、间接免疫荧光、核型分析和裸鼠致瘤试验表明,Sp-POMECs形态呈现典型铺路石样,具有良好的连续分裂增殖性能,表达角蛋白Pan-CK、CK14和CK13,不表达CK18和Vimentin,基本保持了原代POMECs的形态学和生物学特征,无染色体异常和肿瘤转化。4.PCV2和FMDV均能感染hTERT-POMECs和Sp-POMECs,致细胞发生病变,具有良好的复制增殖能力。免疫荧光或PCR表明,PCV2和FMDV均能感染hTERT-POMECs和Sp-POMECs;实时荧光定量PCR和TCID_(50)试验表明,PCV2或FMDV在hTERT-POMECs和Sp-POMECs中的复制增殖能力都高于在PK-15细胞中的复制增殖能力。综上所述,本研究分离培养了原代POMECs,通过转入hTERT和G418抗性筛选获得了永生化细胞系hTERT-POMECs,同时在传代的过程中获得了自发永生化的细胞系Sp-POMECs。PCV2和FMDV均能有效感染hTERT-POMECs和Sp-POMECs,引起细胞病变,具有良好的复制增殖能力。表明猪口腔黏膜上皮细胞是研究猪病毒性疾病的良好细胞模型,建立的永生化细胞系hTERT-POMECs和Sp-POMECs为PCV2和FMDV致病机制的研究提供了重要的实验材料。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-05-01）
王娟[5]（2019）在《甲型H1N1、H3N2流感病毒在MDCK细胞系上的增殖特性研究》一文中研究指出目前动物细胞生物反应器大规模培养技术被广泛应用于病毒类疫苗的生产中。国外应用该技术生产的流感病毒细胞疫苗已通过安全认证并在临床上得到广泛使用。而我国的流感疫苗生产仍以落后的鸡胚工艺为主。鸡胚苗因其生产存在劳动强度大、效率低、批量小、易污染、成本高,发病时还可能出现SPF鸡胚供应不足、应急能力差等缺陷,在生产实践中已日趋淘汰。为了提高流感疫苗的产量、质量和市场竞争力,尽快开发生物反应器大规模培养动物细胞生产流感病毒细胞苗的工艺技术,成为我国疫苗生产企业急待攻克的技术难关。当前,疫苗企业在开发流感细胞疫苗中发现,在大规模培养的动物细胞内,流感病毒增殖效率较低,不能在短时间内达到配制疫苗所要求的病毒滴度,限制了流感病毒细胞苗的开发速度。据报道犬肾来源的MDCK细胞对流感病毒敏感,在兽用疫苗生产中已得到应用。本文通过将两株甲型H1N1和H3N2流感病毒疫苗毒毒株,分别在SPF鸡胚中增殖、扩增,构建工作种毒库,进行了生物学鉴定。然后在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞上进行培养、增殖适应与传代驯化,探索了两株流感病毒在MDCK细胞系上的培养、增殖条件与规律,确定了最佳病毒感染复数(MOI)、最佳接毒与收毒时间,提高了两株流感病毒在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞上增殖后的血凝效价(HA)和病毒滴度(CCID_(50))。其中甲型H1N1株在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞中增殖时,其HA均可达到2~8HA units/25μl;CCID_(50)分别可达到7.50TU/ml和7.32TU/ml;甲型H3N2在两种MDCK细胞中复制,所得毒液的HA略低于H1N1,最高可达2~7HA units/25μl,CCID_(50)最高分别可达7.12 TU/ml和6.79TU/ml,能够满足疫苗生产对抗原含量的要求。最后,根据优化后的病毒培养条件参数,分别将两株病毒在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞上培养、扩增,然后收毒、冻存,进行生物学鉴定,建立了两株病毒的细胞毒工作代毒库和种子毒毒库,为后续利用生物反应器培养MDCK细胞生产流感病毒细胞疫苗,奠定了病毒基础,对以MDCK细胞为培养基质的流感病毒细胞疫苗的开发与生产具有重要意义。(本文来源于《西北民族大学》期刊2019-05-01）
王翠如[6]（2019）在《HOXC10基因对绵羊骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及分化特性的影响》一文中研究指出骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是来源于中胚层的成体干细胞之一,能够分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞等细胞类型,因此,其常作为组织再生的重要的细胞来源之一。然而,目前对BMSCs定向分化分子机制的研究仍然存在疑问,不清楚有哪些因素影响了其分化潜能。最近的研究发现,Homeobox(HOX)基因参与了BMSCs的增殖、凋亡和分化的调节过程。本研究通过分离绵羊BMSCs(sBMSCs)、构建HOXC10的过表达载体及干扰载体,将两种载体利用电转染的方法分别转入sBMSCs中,观察HOXC10对sBMSCs增殖、凋亡的影响。在此基础上分别对sBMSCs进行成脂诱导及成骨诱导,通过油红O染色、脂滴定量检测、茜素红染色、骨钙素定量分析,以及对成脂、成骨相关基因在mRNA及蛋白水平的表达情况检测,研究HOXC10在sBMSCs成脂及成骨分化过程中的功能及其对分化潜能的影响。利用细胞贴壁法分离sBMSCs,通过传代、免疫荧光观察以及细胞诱导检测其干细胞特性,结果表明已成功分离sBMSCs。同时,通过基因片段PCR、连接、酶切等方法成功构建了HOXC10的过表达载体及干扰载体。220V、2.5ms条件下对sBMSCs进行电转染,在电转染48h后进行效率检测,发现HOXC10过表达载体转入sBMSCs后HOXC10表达量较于对照组升高371.68倍,而转染干扰载体的sBMSCs中HOXC10表达量相较于对照组降低了80.38%,表明构建的两个载体为有效载体。电转染后的sBMSCs培养24h、48h、72h后分别加入CCK8(Cell Counting Kit-8),并于450nm处检测吸光度值,发现HOXC10的过表达会促进细胞的生长,HOXC10的干扰会抑制细胞生长。通过流式细胞仪检测HOXC10对于sBMSCs凋亡情况的影响发现:HOXC10过表达会抑制sBMSCs凋亡,而干扰HOXC10则能促进sBMSCs凋亡。分别将转入HOXC10过表达和干扰载体的sBMSCs在成脂诱导3d、6d、12d、18d后通过油红O染色、脂滴定量检测、观察其脂滴形成情况,同时利用qPCR、Western Blot及灰度分析对成脂诱导相关基因LPL、PPARG、Fabp4、ACC的mRNA转录水平及LPL、PPARG的蛋白表达水平进行检测,结果发现HOXC10过表达对于成脂诱导具有促进作用,干扰HOXC10能抑制成脂过程。同时,分别将转入HOXC10过表达和干扰载体的sBMSCs在成骨诱导3d、7d、11d、14d通过茜素红染色、钙结节定量检测观察其钙结节形成情况,并通过qPCR、Western Blot以及灰度分析检测成骨诱导相关基因COLIA1、BMP5、Runx2、OPN的mRNA转录水平及Runx2、OPN的蛋白表达水平,发现HOXC10基因过表达及干扰对于sBMSCs成骨没有明显的作用。本研究结果表明,HOXC10过表达对sBMSCs的增殖起促进作用、对其凋亡起抑制作用,同时能促进成脂。反之,HOXC10干扰则能抑制sBMSCs增殖,促进其凋亡、对成脂起抑制作用。经研究发现HOXC10表达量的变化对sBMSCs成骨没有明显的作用。以上实验研究为今后深入研究HOXC10在BMSCs分化过程中的功能及其对分化潜能的作用机制提供了实验依据。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2019-04-23）
徐浩月,赵宗仁,李顺,赵亮,叶成坤[7]（2019）在《缺氧响应特性的脂质-聚合物放疗增敏剂抑制脑胶质瘤增殖的研究》一文中研究指出目的研究提高脑胶质瘤细胞的放疗(radiotherapy,RT)敏感性的药物及其效果。方法制备有缺氧响应特性的脂质-聚合物[ALP-(MIs) n]放疗增敏剂,并检测其性质:(1)用核磁共振(1H-NMR)检测聚甲硝唑[ALP-(MIs) 25]是否合成成功;(2) Nano-ZS粒度/Zeta电位测定仪检测实验组ALP-(MIS) 25和对照组聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)聚合物(AL-PLGA)在常氧和缺氧环境下的粒径变化,透射电镜观察脂质-聚合物的形态。细胞水平检测:用克隆集落形成实验检测ALP-(MIS) 25对C6细胞株放疗的增敏性。动物水平检测:(1)构建稳转荧光素酶的C6细胞原位小鼠脑胶质瘤模型;(2)检测肿瘤内缺氧环境;(3)检测小鼠脑胶质瘤的荧光素酶强度,统计小鼠的生存时间。结果 ALP-(MIS) n的制备及其性质:(1) ALP-(MIS) n合成成功;(2) ALP-(MIS) n和AL-PLGA构建成功,电镜观察示为圆形结构,ALP-(MIS) n直径为(88. 81±0. 98) nm,AL-PLGA直径为(80. 38±1. 07) nm;相比较于常氧环境下,缺氧环境下ALP-(MIS) 25的水粒学直径增大,圆形结构破坏;而AL-PLGA在缺氧环境下水粒学直径和形态结构均未发生改变。克隆集落形成实验结果显示,与PBS+RT组、AL-PLGA+RT组相比,ALP-(MIS) n+RT组的C6细胞株克隆形成率明显下降,差异有统计学意义(P <0. 01)。稳转荧光素酶的C6细胞原位小鼠脑胶质瘤模型构建成功;缺氧探针免疫荧光实验结果显示脑胶质瘤组织缺氧。与PBS组、PBS+RT组、AL-PLGA+RT组相比,ALP-(MIs) 25+RT组小鼠的胶质瘤增殖速度最慢,中位生存期最长,差异有统计学意义(P <0. 001,P <0. 05)。结论 ALP-(MIS) n联合放射治疗在缺氧环境下可有效抑制脑胶质瘤增殖。(本文来源于《临床神经外科杂志》期刊2019年02期）
云涛,华炯钢,叶伟成,倪征,陈柳[8]（2019）在《新型鸭呼肠孤病毒在DF-1细胞系中的增殖特性》一文中研究指出为了研究新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)在鸡胚成纤维细胞DF-1中的增殖特性,将NDRV JDM10毒株接种到DF-1细胞,连续传代后,通过观察病毒对细胞的致病变效应,测定半数组织感染量(TCID_(50))、RT-PCR检测、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot免疫学检测,探索NDRV对DF-1细胞的作用效果。结果表明,NDRV JDM10毒株在DF-1细胞中能有效增殖,产生明显的致病变效应;RT-PCR检测成功扩增出1条大小为1 001 bp的条带;病毒蛋白在细胞中获得了良好的表达,并与抗NDRVσC单克隆抗体发生特异性反应;NDRV JDM10毒株在感染DF-1细胞后会经历潜伏期、快速增长期、稳定期3个时期,并在72 h病毒效价达到峰值,TCID_(50)为1×10~(-7.90)·(0.1mL)~(-1)。本研究为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞疫苗奠定了基础。(本文来源于《浙江农业学报》期刊2019年05期）
王仕超,张焱如,张瑞剑[9]（2019）在《神经胶质瘤增殖特性与糖代谢机制的研究进展》一文中研究指出癌细胞的糖代谢异常是新近发现的肿瘤组织有别于正常组织的特征之一。研究表明葡萄糖作为主要能量供给者在许多方面与支持细胞功能的合成代谢途径有关,本文主要从有氧糖酵解、戊糖磷酸途径、叁羧酸循环等不同糖代谢途径分析胶质瘤细胞增殖的特性,为脑胶质瘤的临床诊断与治疗提供科学的理论依据。(本文来源于《中华临床医师杂志(电子版)》期刊2019年06期）
王思思,廖晓敏,邵钟铭,袁建玲,封慕茵[10]（2018）在《基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性》一文中研究指出目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析。方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1。应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株。采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P <0. 01)。基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9。CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P <0. 05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P <0. 05); Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P <0. 05)。结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株。NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关; SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2018年12期）
增殖特性论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景牙髓干细胞是一群存在于牙髓组织中间充质来源的成体干细胞,具有高增殖活性、自我更新能力及多向分化潜能。在牙髓损伤修复过程中,可以分化为成牙本质细胞、成纤维细胞等功能细胞,维持局部组织的稳态平衡,在牙髓组织的损伤修复中发挥重要作用。然而,随着年龄的增长,组织干细胞的再生潜能下降。这可能与干细胞数目的减少、固有功能减弱及干细胞所处的微环境改变相关。当牙髓组织暴露于细菌的代谢产物时,可产生不同程度的炎症反应。炎症反应轻微时,牙髓干细胞可分化为成牙本质细胞,参与牙髓组织修复过程,炎症剧烈时可引起牙髓组织坏死。供体年龄作为影响细胞生存微环境的重要因素之一,对牙髓干细胞的增殖和分化具有一定的影响。然而,关于不同年龄供体来源的牙髓干细胞对炎症刺激的反应及修复的能力的差异目前相关报道甚少。故本实验拟采用细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激牙髓干细胞体外模拟炎症微环境,探究不同鼠龄牙髓干细胞在炎症状态下增殖及矿化等相关特性的差异,进一步探究年龄因素对牙髓干细胞受炎症刺激后修复再生能力的影响,为牙髓干细胞在牙髓损伤修复中的应用提供理论基础。材料与方法1.幼龄大鼠牙髓干细胞及成龄大鼠牙髓干细胞分离培养及鉴定采用改良组织块酶消化法从幼龄Sprague-Dawley大鼠及成龄Sprague-Dawley大鼠牙髓组织中分离纯化出牙髓干细胞,命名为幼龄鼠牙髓干细胞(juvenile rat dental pulp stem cells,JDPSCs)与成龄鼠牙髓干细胞(adult rat dental pulp stem cells,ADPSCs)。进行成脂、成骨/成牙本质向诱导分化,检测多向分化潜能;流式细胞术检测相关细胞表面标记物的表达。2.大鼠牙髓组织及牙髓干细胞增龄性变化两种鼠龄牙髓组织切片HE染色、牙髓干细胞及组织切片衰老相关(β-半乳糖苷酶(Senescence p-Galactosidase,SA-P-Gal)染色比较大鼠牙髓组织、牙髓干细胞增龄性变化;CCK8实验、流式细胞术比较JDPSCs和ADPSCs增殖能力。3.不同浓度LPS对JDPSCs和ADPSCs增殖及矿化的影响采用CCK8实验及流式细胞术检测LPS对JDPSCs和ADPSCs增殖能力的影响。在矿化诱导的条件下,采用茜素红染色、碱性磷酸酶染色、qRT-PCR及Western Blot等检测LPS对JDPSCs和ADPSCs成骨/成牙本质向分化的影响。结果1.JDPSCs和ADPSCs的生物学特性及牙髓组织的增龄性变化本实验成功从大鼠牙髓组织中分离纯化出JDPSCs和ADPSCs,两种细胞均可成骨/成牙本质向及成脂向分化,阳性表达间充质干细胞表面标分子记物CD90、CD29,阴性表达造血干细胞表面分子标记物CD45;从刺激的第1d起,在同一时间点下ADPSCs的增殖OD低于JDPSCs(P<0.01),ADPSCs处于S期的细胞比例显着低于JDPSCs(P<0.01);ADPSCs较JDPSCs有更高的SA-β-Gal表达水平(P<0.01);成龄鼠牙髓组织血管含量及组织SA-β-Gal表达较幼龄鼠的增多。2.JDPSCs和ADPSCs在LPS刺激下细胞增殖及矿化的变化CCK8结果显示LPS刺激浓度为0.1-1μg/mL时,从刺激的第1d至第5d,在同一时间点,JDPSCs受LPS刺激实验组较无LPS刺激对照组OD值显着升高,ADPSCs受LPS刺激实验组较对照组的OD值高(P<0.01),且在LPS刺激下JDPSCs组的增加趋势明显大于ADPSCs组;当LPS浓度为10 μg/mL或100 μg/mL时,JDPSCs及ADPSCs在刺激的早期(24 h),同一时间点下,实验组较无LPS刺激的对照组OD值明显升高(P<0.05),而随着刺激时间延长,实验组的OD值降低。在矿化诱导条件下,低浓度的LPS(<1 μg/mL)均能促进JDPSCs和ADPSCs矿化结节形成,JDPSCs增多趋势较ADPSCs明显;RT-PCR及Western Blot结果表明低浓度LPS促进JDPSCs和ADPSCs矿化相关基因(ALP、OCN、BSP、DSPP)及蛋白(ALP)的表达,且JDPSCs促进趋势明显高于ADPSCs。结论1.幼龄及成龄大鼠牙髓组织中可分离培养出牙髓干细胞,JDPSCs和ADPSCs均为间充质来源,具有多向分化潜能。JDPSCs比ADPSCs有较高增殖能力,较低的SA-p-Gal表达水平。2.低浓度LPS(0.1-1 μg/mL)促进JDPSCs及ADPSCs的增殖,并且对JDPSCs促进程度明显大于ADPSCs。较高浓度(10μg/mL或100μg/mL)LPS短时间(24 h)刺激可促进JDPSCs及ADPSCs的增殖,随着刺激时间的延长抑制增殖。3.低浓度的LPS(0.5 μg/mL)可以促进JDPSCs和ADPSCs矿化相关基因及蛋白的表达,及矿化结节的形成,LPS对JDPSCs成骨/成牙向分化的促进作用较ADPSCs明显,提示JDPSCs较ADPSCs在一定程度的炎症微环境中有更强的修复能力。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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