木麻黄耐盐相关基因挖掘及功能验证

论文摘要

木麻黄（Casuarina equisetifolia Forst.）是一种原产于热带、亚热带的典型沿海防护林树种,其基因组较小,种子数量较多,很适合作为耐盐研究的模式树种。然而,其耐盐机制尚不清楚。本研究对木麻黄进行了0,100 mM,200 mM盐胁迫处理和转录组测序。通过GO分类、KEGG代谢通路及差异基因表达分析确定了CeCIGR1作为耐盐候选基因并进行了荧光定量PCR验证。利用根癌农杆菌介导的转基因技术侵染杨树茎段外植体,对鉴定为阳性的转基因杨树进行盐胁迫下的生理指标测定。得到的主要结果如下:一、转录组测序共得到57850条Unigene,最短的Unigene长度为201 nt,最长13035 nt。在eggNOG数据库中共有55.48%的Unigene被注释,是六大数据库（Nr、eggNOG、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot）中注释程度最高的;GO功能分类占比最高的是细胞组件,占了所有Unigene的33%,KEGG代谢通路注释有32.8%是新陈代谢通路,占比最高;根据Nr数据库中蛋白序列相似度对比,发现有46.63%的蛋白序列与胡桃同源,是与木麻黄亲缘关系的最近的物种;差异表达基因的GO功能分类显示,木麻黄在盐胁迫下茎差异表达基因主要富集在糖代谢相关,激素信号传导,跨膜运输等,而根部的差异表达基因大部分都与核糖体有关。茎差异表达基因的KEGG代谢通路主要与糖代谢相关,包括蔗糖、淀粉、半乳糖等。在根部基因富集最多的也是核糖体相关,其它还有光合作用、氮代谢、氧化磷酸化和泛酸与辅酶A生物合成等。二、从木麻黄转录组数据中挑选了10个差异表达基因,成功了克隆5个基因（CeATHB7,CeIKU2,CeNCS2,CePM19L,CeCIGR1）并构建了过表达载体,其中CeNCS2、CePM19L和CeIKU2与跨膜运输相关,CeATHB7与DNA特异结合的转录因子,CeCIGR1响应赤霉素。利用杨树遗传转化体系,将五个重组的过表达载体转化侵染杨树茎段外植体,最后鉴定得到CeCIGR1转基因株系。三、对CeCIGR1株系进行荧光定量PCR鉴定,发现木麻黄CeCIGR1基因的相对表达量在对照中整体下降,而在100 mM和200 mM盐处理后CeCIGR1的相对表达量均是在短时间内升高后再下降,说明CeCIGR1响应盐胁迫导致相对表达量上升。四、对过表达CeCIGR1基因杨树进行盐胁迫生理指标的测定。叶绿素快速荧光参数显示,对比野生型杨树,过表达植株的叶片在盐溶液浸泡24h后的损伤程度更低;比较野生型和过表达株系在盐胁迫下的POD和CAT活性及MDA含量发现,过表达植株的叶片在盐胁迫下的POD和CAT活性降低量和MDA含量升高量均要小于野生型。表明转基因植株对高盐环境的耐受能力更强。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 绪论
• 1.文献综述
•   1.1 木麻黄耐盐性
•   1.2 木麻黄的遗传改良
•   1.3 植物盐胁迫研究现状
•     1.3.1 盐胁迫对植物生理指标的影响
•     1.3.2 植物对盐胁迫的缓解机制
•   1.4 转录组研究进展
•     1.4.1 转录组简介
•     1.4.2 测序技术的发展
•     1.4.3 转录组测序
•     1.4.4 转录组测序在抗逆机理中的应用
•   1.5 研究目的及意义
•   1.6 技术路线
• 2 木麻黄转录组特征与耐盐基因挖掘
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料收集
•     2.1.2 材料处理
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 总RNA提取及检测
•     2.2.2 cDNA文库构建
•     2.2.3 转录组分析流程
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 RNA总质量检测
•     2.3.2 基因组装结果统计
•     2.3.3 基因功能注释和分类
•     2.3.4 差异表达基因分析
•   2.4 讨论
• 3 木麻黄耐盐基因克隆及功能验证
•   3.1 材料及仪器试剂
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 菌种及载体
•     3.1.3 主要试剂与仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 木麻黄总RNA提取
•     3.2.2 cDNA合成
•     3.2.3 耐盐相关基因克隆
•     3.2.4 过表达载体构建
•     3.2.5 农杆菌（GV3101）感受态制备
•     3.2.6 农杆菌感受态转化
•     3.2.7 杨树的遗传转化
•     3.2.8 转基因阳性植株鉴定
•     3.2.9 木麻黄CeCIGR1 基因的qPCR验证
•     3.2.10 叶绿素快速荧光参数测定
•     3.2.11 盐胁迫相关生理指标测定
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 RNA质量检测
•     3.3.2 过表达载体构建
•     3.3.3 杨树的遗传转化及鉴定
•     3.3.4 盐胁迫对CeCIGR1 相对表达量的影响
•     3.3.5 盐胁迫对野生型与转基因杨树生理指标的影响
•   3.4 讨论
• 4 总结
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 金继祖

导师: 柳参奎

关键词: 木麻黄,盐胁迫,基因挖掘,过表达,生理响应

来源: 浙江农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,林业

单位: 浙江农林大学

基金: 浙江省农业新品种育种科技重大专项(典型树种抗(耐)逆境胁迫研究)2016C02056-1项目

分类号: Q943.2;S792.93

总页数: 72

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