BVDV E0抗体制备及干扰素敲除的MDBK细胞系构建

论文摘要

牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea,BVD）又称牛病毒性腹泻-黏膜病,是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的一种严重的传染性疾病。BVD可以导致被感染动物产生免疫抑制、生殖功能障碍以及持续性感染等疾病。它会对家畜产生很大的影响,同时会给全球的养牛产业带来巨大的经济损失。世界动物卫生组织（Office international desépizooties,OIE）将其定义为B类传染病。BVDV属于黄病毒科,瘟病毒属,是一种单链正义RNA病毒。其基因组长度约12.3kb,包含5’非编码区（5’-untranslated regions,5’-UTR）,开放阅读框（open reading frame,ORF）及3’非编码区（3’-untranslated regions,3’-UTR）功能区,从该ORF翻译的蛋白质由细胞和病毒蛋白酶进行翻译后加工而产生十二种成熟蛋白质。包括四种结构蛋白（C、Erns、E1和E2）和八种非结构蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。包膜蛋白Erns（E0）,又被称为gP48,由ORF的8111491位核苷酸编码,由约227个氨基酸残基组成,E0非结构蛋白主要参与病毒囊膜结构形成的过程,E0是瘟病毒的编码蛋白中保守性相对来说较高的蛋白,其上有中和表位,将其作为抗原进行动物免疫实验产生的中和抗体具有中和BVDV和猪瘟病毒（CSFV）的能力。经过氨基酸序列分析软件分析结果显示,在E0蛋白内有一高度保守结构域,而高度保守结构域对于研发亚单位疫苗来讲,是必不可少的一类结构域,因此E0蛋白可用于基因工程诊断抗原,或者制备多克隆抗体。CRISPR/Cas系统主要是由CRISPR阵列元件与Cas基因家族组成。系统包含一组Cas基因,非编码RNA和独特的重复元件阵列。CRISPR/Cas系统依赖于将外源DNA片段摄取到CRISPR基因座,随后将这些CRISPR重复间隔区阵列转录和加工成短的CRISPR RNA（crRNA）,然后与反式激活的crRNA退火（tracrRNA）和由Cas蛋白外源核酸的直接序列特异性沉默,体外研究表明,由crRNA和tracrRNA融合组成的单一合成指导RNA（gRNA）可指导Cas9介导的靶DNA切割,通过造成基因移码使基因表达程度减弱或者不表达。本研究利用原核表达载体成功表达并纯化出纯度较高的E0蛋白,其中可溶性蛋白浓度较低,包涵体蛋白浓度较高,故选用包涵体蛋白作为抗原,免疫小鼠,背部皮下多点注射,初次免疫之后,每隔两周加强免疫,最后大量取血,经过ELASA和Western Blot验证,成功获得效价较高的抗E0蛋白的多克隆抗体,可用于后续检测本实验中所用细胞系产生的BVDV。目前增殖细胞系BVDV的滴度较低,导致疫苗成本较高,主要是可能是细胞中的干扰素会抑制BVDV在细胞中的增殖,使增殖效率大大降低,导致疫苗成本较高,故本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除BoIFN基因,使干扰素不表达或者表达量降低。目前已设计多条gRNA,并成功构建了慢病毒质粒LentiCRISPR V2-gRNA,利用慢病毒包装的方法将MDBK基因组中的干扰素基因敲除。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
•   1 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）研究概况
•     1.1 BVDV简述
•     1.2 BVDV病原学
•     1.3 BVDV疫苗研究概况
•   2 干扰素基因的研究进展
•     2.1 牛干扰素α基因及其功能
•     2.2 牛干扰素β基因及其功能
•   3 基因编辑技术的研究概况
•     3.1 ZFN技术
•     3.2 TALLEN技术
•     3.3 CRISPR/Cas9 技术
•   4 研究目的及意义
•   5 研究内容
•   6 技术路线
• 第二章 BVDV Erns蛋白的原核表达与纯化
•   1 实验材料
•     1.1 实验动物
•     1.2 载体和菌株
•     1.3 主要仪器设备
•     1.4 实验试剂
•     1.5 溶液配制
•   2 实验方法
•     2.1 构建E0 原核表达载体
•     2.2 E0 原核表达载体的鉴定
•     2.3 重组质粒pET-28a-E0 的表达与纯化
•     2.4 SDS-PAGE和 Western Blot检测蛋白纯化
•   3 实验结果
•     3.1 pET-28a-E0 阳性菌落及双酶切鉴定
•     3.2 SDS-PAGE鉴定最佳诱导条件
•     3.3 E0 蛋白可溶性分析
•     3.4 E0 蛋白纯化
•     3.5 E0 蛋白Western Blot
•   4 讨论
• 第三章 BVDV E0 蛋白免疫原性研究
•   1 实验材料
•     1.1 实验试剂
•     1.2 溶液配制
•   2 实验仪器
•   3 实验方法
•     3.1 E0 蛋白抗血清的制备
•     3.2 E0 蛋白抗血清效价的测定
•     3.3 E0 蛋白抗血清特异性检测
•   4 实验结果
•     4.1 E0 蛋白抗血清效价的测定
•     4.2 E0 蛋白抗血清特异性检测
•   5 讨论
• 第四章 CRISPR/Cas9 敲除牛干扰素基因
•   1 实验材料
•     1.2 实验试剂
•     1.3 溶液配制
•   2 实验仪器
•   3 实验方法
•     3.1 设计gRNA
• 2-gRNA'>    3.2 构建慢病毒敲除质粒LentiCRISPR V₂-gRNA
•     3.3 慢病毒包装
•     3.4 筛选单克隆细胞
•     3.5 鉴定敲除效果
•   4 实验结果
• 2-gRNA的构建'>    4.1 慢病毒LentiCRIPR V₂-gRNA的构建
•     4.2 敲除效果鉴定
•     4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韩慧慧

导师: 何成强

关键词: 蛋白,原核表达

来源: 山东师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东师范大学

基金: 山东省重点研发计划(2017GNC10125)

分类号: S852.65

总页数: 75

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