铜绿假单胞菌DN1高产鼠李糖脂基因工程菌株的构建及其对石油污染土壤修复的实验研究

论文摘要

石油污染是亟待解决的环境问题之一,生物修复被认为是理想的方法。石油污染物由于水溶性小致使生物可利用性低,一般需投加表面活性剂提高其修复效率。鼠李糖脂作为一种生物表面活性剂,具有无毒、易降解、可增溶疏水性有机物等优点而具有广阔的应用前景。然而,由于鼠李糖脂的生产成本高、产量低等问题而没有被广泛使用。本论文以产鼠李糖脂表面活性剂的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DN1为研究对象,构建高产鼠李糖脂基因工程菌株并对营养参数进行优化,促进其产鼠李糖脂的能力,在此基础上探究鼠李糖脂协同降解菌在修复石油污染土壤的应用潜力。首先利用分子生物学手段将鼠李糖脂合成关键基因rhlAB和rhlC分别转入铜绿假单胞菌DN1,构建基因工程菌株DNAB和DNC;然后对微生物摇瓶生产鼠李糖脂过程中的营养参数进行优化。结果表明:以6种碳源（棕榈油、菜籽油、豆油、甘油、玉米油、橄榄油）为唯一碳源培养时,橄榄油是最佳的碳源;6种氮源（氯化铵、硝酸钠、硝酸铵、硝酸钾、硫酸铵、尿素）为唯一氮源,最佳氮源是硝酸钠。当C/N比为20时,工程菌株DNAB和DNC的鼠李糖脂产量分别达到19.3g/L和22.5g/L,相比DN1的14.2g/L增加到1.35倍和1.58倍。由此可见,增加菌株DN1的rh1AB和rh1C的基因拷贝数并进行营养参数优化,可以提高鼠李糖脂的产量。同时,通过ESI-MS分析得出野生型和工程菌株之间的鼠李糖脂种类和数量差异,发现Rha-Rha-C10和Rha-Rha-C10-C10是工程菌株产生的最优势的鼠李糖脂结构。在此基础上利用鼠李糖脂协同降解菌对石油污染的土壤进行修复,通过检测石油烃的降解效率以及石油污染土壤本源微生物种群多样性的变化,探究投加鼠李糖脂协同降解菌的修复效果。结果表明:35天的修复过程中,相比较未经处理（NA）的石油烃去除率43%,鼠李糖脂协同降解菌修复（BMR）对石油烃的去除效果最好,可达到81%,只施加降解菌修复（BM）对土壤中石油烃的去除率为63%,而只添加鼠李糖脂修复（BR）没有明显提高石油烃的降解率（39%）。多样性分析表明,与未经处理（NA）的土壤微生物多样性相比,只添加鼠李糖脂（BR）和只采用降解菌的修复（BM）提高了土壤微生物群落的丰富度,鼠李糖脂协同外源降解菌的修复（BMR）不仅可以提高土壤群落的丰富度,而且提升了土壤群落的均匀度。属水平上发生极大变化,未经处理的（NA）土壤的优势属有诺卡氏菌属（Nocardioides）和戈登式菌属（Gordonia）,仅施加鼠李糖脂修复（BR）和只添加降解菌修复（BM）出现新的优势属为假单胞菌属（Pseudomonas）,而诺卡氏菌属（Nocardioides）丰度下降;鼠李糖脂协同降解菌修复（BMR）的土壤中出现更多新的石油烃降解优势属,如分枝杆菌属（Mycobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacte）、根瘤菌属（Rhizobiaceae）、空洞菌属（Cavicella）和黄假单胞菌（Pseudoxanthomonas）等,这些石油烃降解优势属的增加显著提高降解菌对土壤中石油烃的去除效果,使得土壤中石油烃降解率可达到81%。此外石油烃降解相关酶丰度的变化结果表明了鼠李糖脂提高了与碳氢化合物降解和转运蛋白有关的酶,增强了降解细菌向修复部位的转运并促进生物降解碳氢化合物。由此可见,鼠李糖脂协同降解菌能有效去除石油污染土壤中的石油烃,并使土壤微生物群落结构发生明显变化,使得易降解石油烃的微生物更富集,在石油污染土壤修复方面具有应用潜力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语对照表
• 第一章 绪论
•   1.1 石油污染的危害及治理
•     1.1.1 石油污染的危害
•     1.1.2 石油污染的修复技术
•   1.2 微生物修复石油污染
•     1.2.1 降解石油烃的微生物
•     1.2.2 微生物修复石油污染土壤的现状
•     1.2.3 铜绿假单胞菌在生物修复中的应用
•   1.3 表面活性剂在石油污染修复的研究
•     1.3.1 表面活性剂对石油污染土壤的作用机理
•     1.3.2 表面活性剂对石油污染土壤的修复现状
•   1.4 生物表面活性剂鼠李糖脂的性质及生产
•     1.4.1 鼠李糖脂的结构和理化性质
•     1.4.2 鼠李糖脂的生产工艺
•     1.4.3 不同营养元素对鼠李糖脂生产的影响
•     1.4.4 提高鼠李糖脂产量的其他措施
•   1.5 本论文的研究内容及意义
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 实验使用试剂及配置
•     2.1.3 培养基
•     2.1.4 实验使用仪器设备
•   2.2 产鼠李糖脂工程菌的构建及其营养体系优化方法
•     2.2.1 构建载体质粒pAKrhl AB和 pAKrhl C
•     2.2.2 载体质粒的提取
•     2.2.3 高产鼠李糖脂基因工程菌株DNAB和 DNC的构建
•     2.2.4 培养基营养体系的优化
•     2.2.5 鼠李糖脂的提取及表面特性研究
•     2.2.6 鼠李糖脂组成分析
•   2.3 石油污染土壤的修复
•     2.3.1 石油污染的土壤来源及预处理
•     2.3.2 石油烃降解混合菌的制备
•     2.3.3 修复方案设计
•     2.3.4 总石油烃的测定
•     2.3.5 烷烃和多环芳烃的测定
•     2.3.6 土壤微生物群落多样性的测定
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 产鼠李糖脂基因工程菌的构建
•   3.2 鼠李糖脂生产的营养参数优化
•     3.2.1 碳源的优化
•     3.2.2 氮源的优化
•     3.2.3 C/N比的优化
•   3.3 野生型菌株DN1 和工程菌株生产的鼠李糖脂的表面特性
•   3.4 野生型菌株DN1 和工程菌产生的鼠李糖脂组成和结构
•   3.5 不同修复处理石油污染土壤
•     3.5.1 不同修复对石油烃的降解效率
•     3.5.2 不同修复对多环芳烃和烷烃组分的降解影响
•   3.6 不同修复处理对土壤本源群落多样性和结构的影响
•     3.6.1 16S rDNA测序质量控制
•     3.6.2 不同修复处理对土壤微生物群落多样性的影响
•     3.6.4 不同修复处理的土壤微生物纲水平群落结构
•     3.6.5 不同修复处理的土壤微生物属水平群落结构
•     3.6.6 有无鼠李糖脂协同降解菌修复的显著差异分析
•   3.7 不同修复处理中碳氢化合物降解酶的丰度
• 第四章 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间取得的科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄朝

导师: 马艳玲

关键词: 石油污染土壤,鼠李糖脂,铜绿假单胞菌,基因工程菌,生物修复

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 西北大学

分类号: X53;Q78

总页数: 75

文件大小: 2491K

下载量: 616