张崇华闫海韩钰
哈尔滨市疾病预防控制中心150056
摘要：目的应用两种微核试验对饮用水遗传毒性进行检测比较的灵敏性、有效性。方法采用蚕豆根尖微核试验和人外周血淋巴细胞微核试验分别对某市的饮用水的有机浓集物的遗传毒性进行检测。结果1水厂水源水、末梢水和2厂的末梢水诱导的微核细胞千分率与对照组差异无显著性，污染指数在1.5-2.0之间，属于轻度污染。2厂的水源水诱导的微核细胞千分率与对照组差异无显著性，污染指数小于1.5，基本无污染。两个水厂的出厂水诱导的微核细胞千分率与对照组有显著差异，污染指数在2.0-3.5之间，属于中度度污染。两个水厂检测结果一致，都存在经过消毒工艺后水的致突变性增加的现象。结论对于遗传毒性的检测，两种方法都比较稳定，蚕豆根尖微核技术适用于低剂量致变因子遗传毒性的检测分析，人外周血淋巴细胞微核试验能更好的反映致变因子对人体的影响。
关键词：蚕豆根尖微核试验；人外周血淋巴细胞微核试验；遗传毒性
水资源是人类生存和社会发展的必备资源，由于各种环境污染物向水体的大量排放导致水中的有机污染物的种类和数量急剧增加，对人类健康造成严重威胁。因此开展水环境的遗传毒性检测，特别是有机化学物遗传毒性检测对保障人民群众的健康具有重要的意义。本研究釆用人外周血淋巴细胞微核试验及蚕豆根尖细胞微核试验对水环境样品进行遗传毒性检测，并根据检测结果划分水质污染程度，为水环境污染及风险评价提供科学依据。
1材料和方法
1.1材料与仪器
1.1.1材料松滋青皮蚕豆（中国疾控中心提供）、卡诺氏固定液、席夫试剂、HLB固相萃取柱、健康男性肘静脉血（肝素抗凝）、细胞松弛素-B、Giemsa染液、二甲基亚砜、PBS缓冲液。
1.1.2仪器超净工作台、CO2培养箱、莱卡显微镜（DM6000B）、固相萃取仪、细胞计数器。
1.2方法
1.2.1水样的采集处理
采集某市两个自来水厂入厂的水源水、出厂水及管网末梢水各5L，用HLB固相萃取柱将水样浓缩，用氮吹仪吹干，丙酮洗脱，用二甲基亚砜定容，使1.5ml定容液相当于2L水样，贮于4℃冰箱备用。
1.2.2蚕豆根尖细胞微核试验试验方法采用中国疾控中心提供的方法[1、2]。将当年松滋青皮豆按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯中，置25℃的温箱内催芽，种子大部分初生根长至2~3cm，根毛发育良好，选取4粒出生根尖生长良好、根长一致的种子，放入盛有被测液的培养皿中，让被测液浸泡住根尖即可。染毒24h。用蒸馏水浸洗3次，每次2~3min。再放入铺好湿脱脂棉的解剖盘（或铝盒）内，使根尖细胞恢复24h。将恢复培养后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根放入青霉素空瓶中，加入卡诺氏固定液固定24h。固定后的幼根如不及时制片，可换入70%的乙醇中，置4℃冰箱内保存备用。固定好的幼根，用蒸馏水浸洗2次，吸净蒸馏水，加入5NHCl于28℃水浴锅中水解，幼根被软化后用蒸馏水浸泡洗净，在暗室或遮光的条件下加席夫（Schiff）试剂，染色10min..除去染液，用SO2洗涤液浸洗幼根2次，用蒸馏水浸洗一次，5min。将幼根放入新换的蒸馏水中，置4℃的冰箱内保存，可供随时制片。将幼根放在擦净的载玻片上，用解剖针截下1mm左右的根尖。滴上少许45%的醋酸溶液，用解剖针将根尖捣碎，加盖一清洁的盖玻片，注意不要有气泡。再在盖玻片上加一小块滤纸，轻轻敲打压片，切勿让盖玻片与载玻片之间滑动。
1.2.3人外周血淋巴细胞微核试验采用胞质分裂阻断法（CBMN法）进行检测[3]，空白对照用蒸馏水，阴性对照为溶剂DMSO，阳性对照为丝裂霉素-C（终浓度为0.1μg/ml）。将0.4ml的肝素抗凝全血置于5%CO2培养箱中37℃培养44h，加入0.2ml细胞松弛素-B应用液，再加入浓缩样50μl，进行染毒72h后收获细胞。离心（150×g）后去上清，缓慢加入2ml0.075mol/L的KCl低渗溶液，轻柔吹匀后立即加入1.5ml固定液（甲醇和冰醋酸体积比为4∶1），离心去上清。再次加入3ml固定液，离心去上清，直至离心管中的液体透明。将剩余0.5ml左右的固定液吹散后滴片，10%的Giemsa染色10min，晾干待测。
1.3微核的观察与计数高倍镜下计数1000个细胞中含有微核的细胞数，计算微核率（MN‰）和核率比值（即污染指数，PI值）。
污染指数的评价：0<PI<1.5时，基本无污染；1.5≤PI<2.0时，轻度污染；
2.0≤PI<3.5时，中度污染；PI≥3.5时，重度污[7][8]染，一般认为PI≥1.5时判断样本具有遗传毒性[4]。
1.4实验结果采用SPSS13.0统计软件进行分析，采用Dunnett’st检验对各染毒组与对照组之间的MCN进行统计检验，以α=0.05为检验水准。
2结果
2.1蚕豆根尖细胞微核试验
从表1可见，阴性对照和阳性对照均在正常检测范围，试验成立。两个水厂的三个水样属于一个完整的氯化消毒处理工艺的三种水质，1厂的水源水、末梢水和2厂的末梢水诱导的微核细胞千分率与对照组差异无显著性，污染指数在1.5-2.0之间，属于轻度污染。2厂的水源水诱导的微核细胞千分率与对照组差异无显著性，污染指数小于1.5，基本无污染。两个水厂的出厂水诱导的微核细胞千分率与对照组有显著差异，污染指数在2.0-3.5之间，属于中度度污染。两个水厂都存在经过消毒工艺后水的致突变性增加的现象。
2.2人外周血淋巴细胞微核试验
如表1所示，阴性对照和阳性对照均在正常检测范围，试验成立。1厂的水源水、末梢水和2厂的末梢水诱导的人淋巴细胞的微核细胞千分率与对照组差异无显著性，污染指数在1.5-2.0之间，属于轻度污染。2厂的水源水诱导的微核细胞千分率与对照组差异无显著性，污染指数小于1.5，基本无污染。两个水厂的出厂水诱导的微核细胞千分率与对照组有显著差异，污染指数在2.0-3.5之间，属于中度度污染。与蚕豆根尖细胞微核试验的检测结果相同。经过常规处理工艺后水至遗传毒性增加，和其他研究报道结论一致，人外周血淋巴细胞微核试验是一种有效的检测方法。
3讨论
两种方法在本研究中都取得了很好的检测结果，都可以应用到以后的检测工作中。蚕豆根尖微核检测技术是被广泛应用的标准方法，利用蚕豆初生根尖细胞对诱导物反应敏感的特点，以细胞染色体受损伤程度为指标，用于检测污染物对环境污染的程度，能很好地反映污染物对生物和人群的危害状况，具有化学监测不能达到的效果，该方法简单、灵敏，可有效的评价饮用水低剂量致变因子的遗传毒性效应，但因取材、季节和气候原因在北方寒冷地区使用受限。人外周血淋巴细胞微核试验胞质分裂阻断法是采用人体细胞，能更好的反映对人体的危害。检测计数的是一次分裂的细胞微核，克服了常规法中的不能同步的问题，增加了检测结果的敏感性、稳定性。由于取材方便，更适用于高寒地区的检测。
饮水安全与人群健康密切相关，建立一套有效的测试体系评价水中有机物对人体健康的影响尤为重要。本研究利用两种微核试验技术，分别用人体细胞和植物细胞对水质遗传毒性进行了检测，取得很好的效果。由于研究的是对人体的健康影响，采用人外周血淋巴细胞微核试验能更好反映化合物对人体的损伤，是一种快速、有效的生物学检测方法。
参考文献：
[1]中国环境保护部.水和废水监测分析方法[S].4版.北京：北京科学技术出版社，2002.
[2]王超，阮鸿洁，豆捷雄等.采用蚕豆根尖试验检测自来水厂水体的遗传[J].癌变.畸变.突变，2016，28（6）：481－483.
[3]FenechM.Cytokinesis-blockmicronucleuscytomeassay[J].NatProtoc，2007，2：1084－1104.
[4]陈光荣，金波，李明.污染指数在微核技术监测水质污染中的应用[J].中国环境科学，1986，6（2）：60-63.