甲基-CpG结合结构域蛋白2抑制PRRSV复制的研究

论文摘要

为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2 （MBD2）在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36、48 h后分别取样,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blots试验进行检测。结果表明,PRRSV感染下调MBD2的mRNA和蛋白的表达水平。用真核表达载体pc DNA 3.1-Flag构建了MBD2的真核表达质粒pc DNA3. 1-Flag-MBD2,用pc DNA3. 1-Flag-MBD2转染MARC-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后收获细胞。TCID50的试验结果表明,过表达MBD2能降低PRRSV滴度,而qRTPCR和Western blots的结果则表明MBD2能降低PRRSV的载量;相反,MBD2的siRNA试验表明,下调表达有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。通过基因缺失试验,构建MBD2部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制起关键的作用。研究结果表明,MBD2是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 毒株、细胞
•   1.2 主要试剂与载体
•   1.3 引物设计与合成
•   1.4 siRNA的合成
•   1.5 pcDNA3.1-Flag-MBD2载体的构建
•   1.6 转染与接毒
•   1.7 双荧光素酶报告试验
•   1.8 qRT-PCR反应
•   1.9 TCID50的测定
•   1.1 0 Western blot检测
•   1.1 1 统计学分析
• 2 结果与分析
•   2.1 MBD2的克隆与序列分析
•   2.2 验证MBD2是miR-373的靶基因
•   2.3 PRRSV抑制MARC-145细胞中MBD2的表达
•   2.4 过表达MBD2对PRRSV复制的影响
•   2.5 下调MBD2的表达对PRRSV复制影响
•   2.6 构建真核表达载体MBD2的截短质粒
•   2.7 MBD2不同结构域对PRRSV复制的影响
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 赵慧君,赵旭阳,史西保,陈静,范小敏,王丽,李青梅,常晓博,邓瑞广,张改平

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,甲基结合结构域蛋白

来源: 河南农业大学学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学生命科学学院,河南省农业科学院动物免疫学重点实验室,河南师范大学生命科学学院,西北农林科技大学动物医学院

基金: 河南省自然科学基金项目(182300410077),农业部动物免疫学重点实验室,河南省动物免疫学重点实验室开放课题(PKLAI20170605),河南省高等学校重点科研项目(17A180006),河南师范大学优秀青年科学基金项目(校20170031),2018年河南师范大学大学生创新创业训练项目

分类号: S852.651

DOI: 10.16445/j.cnki.1000-2340.20191120.007

页码: 903-911+917

总页数: 10

文件大小: 2187K

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