黄孢原毛平革菌对四溴双酚A的降解转化及蛋白组学研究

论文摘要

四溴双酚A（TBBPA）是使用量最大的溴代阻燃剂之一,容易释放到各种环境介质中并造成污染。由于TBBPA具有一定的生物毒性和生物累积性,给生态系统和人类的健康安全带来潜在威胁,因此针对其高效降解技术的研究备受关注。微生物修复是去除环境中有毒有害环境污染物的一种重要手段,其中,白腐真菌因其强大的酶系统在多种有机污染物的降解过程中发挥重要作用。目前关于白腐真菌去除TBBPA的研究主要集中于真菌所分泌的漆酶对TBBPA的降解路径,而非真菌直接生物转化TBBPA的机理,对真菌降解TBBPA的蛋白分子机制的研究甚少。鉴于此,本研究选用黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）作为实验菌株,开展对TBBPA的去除性能、降解途径、解毒特性和蛋白质水平的降解机制研究,此外,还初步考察了P.chrysosporium应用于水/沉积物体系中TBBPA生物强化修复的可行性。本论文取得的主要研究结果如下:（1）P.chrysosporium对TBBPA的去除效果与多种环境因素有关,通过单因素优化实验确定了TBBPA去除的最佳条件为:初始pH 45,葡萄糖浓度5 g/L,孢子液接种体积比为5%,TBBPA浓度5 mg/L。在最佳条件下反应3 d后,TBBPA去除率可达97.7%。低浓度（5 mg/L）Cd2+对TBBPA的去除没有显著影响,高浓度（≥20 mg/L）Cd2+则显著抑制P.chrysosporium对TBBPA的去除。外源添加细胞色素P450酶抑制剂可以显著降低TBBPA的去除率,表明菌体细胞色素P450酶参与了TBBPA的降解过程。（2）利用LC-Q-TOF-MS/MS鉴定出7种TBBPA代谢产物,包括:四溴双酚A葡萄糖苷、三溴双酚A、三溴双酚A葡萄糖苷、单羟基四溴双酚A、4-（2-羟基-异丙基）-2,6-二溴苯酚、4-（2-甲氧基-异丙基）-2,6-二溴苯酚以及对羟基苯甲酸。发现除了脱溴途径和氧化裂解途径,真菌还能通过糖苷化和羟基化途径转化TBBPA。为明确P.chrysosporium对TBBPA的解毒特性,以HepG2为模式细胞,考察了不同浓度TBBPA及降解3 d的代谢混合物的细胞毒性效应,结果显示TBBPA（1050μmol/L）以浓度依赖性方式诱导HepG2细胞中过量ROS的累积,从而引起线粒体损伤并导致线粒体膜电位下降,最后诱发HepG2细胞凋亡。TBBPA代谢混合物对细胞ROS含量、线粒体膜电位以及细胞凋亡的影响较小。TBBPA诱导HepG2细胞阻滞于G0/G1期,处于S期的细胞比例减少。TBBPA代谢混合物对细胞周期的扰乱作用弱于TBBPA。研究表明,TBBPA对HepG2的细胞毒性与细胞周期调控及线粒体途径介导的细胞凋亡有关,P.chrysosporium降解TBBPA后产生的代谢混合物表现出更低的细胞毒性。（3）iTRAQ蛋白质组定量分析结果表明,在P.chrysosporium降解TBBPA的过程中共有148个蛋白发生差异表达,其中90个蛋白表达上调,58个蛋白表达下调。蛋白功能分析结果表明,降解过程中P.chrysosporium细胞内2种细胞色素P450酶、3种谷胱甘肽S-转移酶、2种UDP-葡糖基转移酶、1种O-甲基转移酶和其他氧化还原酶的表达显著上调,它们可能参与了P.chrysosporium转化TBBPA过程中羟基化、还原脱溴、糖苷化、O-甲基化以及其他氧化反应。此外,TBBPA胁迫诱导P.chrysosporium胞内磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、天冬氨酸-tRNA连接酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶4催化亚基的表达上调,用于产生更多的能量并抵抗氧化胁迫。此外参与氨基酸合成和分解代谢途径的多种相关蛋白表达受到抑制。（4）生物强化降解实验结果表明水/沉积物样品中可能存在能降解TBBPA的微生物,未灭菌对照组中TBBPA的降解率为13.91%,生物强化组、生物强化-生物刺激组中TBBPA的降解率分别显著提高至40.19%和78.87%。这两组处理方法均对微生物群落结构产生影响,并导致某些功能菌群得到强化:生物强化使原毛平革菌属成为水/沉积物体系中的优势真菌,优势细菌为黄杆菌属（0.3%4.4%）和生孢噬纤维菌（1.0%2.8%）。生物强化-生物刺激处理后,假单胞菌属大量富集（9.6%17.3%）,生孢噬纤维菌属（1.0%5.5%）的比例也有所增加,推测假单胞菌属可能是TBBPA降解增强的主要原因。此外生孢噬纤维菌属和黄杆菌属也具有潜在的TBBPA降解能力。多种与异生素代谢及微生物细胞自我保护相关的功能基因,如烯酰辅酶A水合酶、3-氧酰基-（酰基载体蛋白）还原酶、谷胱甘肽S-转移酶、甲基接受趋化蛋白和ATP结合盒B亚家族在生物强化-生物刺激组中富集。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 四溴双酚A的分布与特性
•     1.1.1 四溴双酚A概述
•     1.1.2 四溴双酚A的应用与污染现状
•     1.1.3 四溴双酚A的特性
•   1.2 四溴双酚A微生物降解及机理研究
•     1.2.1 四溴双酚A厌氧生物降解机理
•     1.2.2 四溴双酚A好氧生物降解机理
•   1.3 白腐真菌及其在有机物降解转化中的应用
•     1.3.1 白腐真菌概述
•     1.3.2 白腐真菌对有机污染物的降解和转化
•   1.4 蛋白质组学在环境污染微生物修复中的应用
•   1.5 生物强化降解及微生物群落研究
•     1.5.1 生物强化与生物刺激
•     1.5.2 TBBPA生物强化降解和微生物群落研究进展
•   1.6 本论文的研究工作
•     1.6.1 研究目的及意义
•     1.6.2 主要研究内容
•     1.6.3 技术路线
•     1.6.4 创新点
• 第二章 P.chrysosporium去除TBBPA的性能研究
•   2.1 材料与设备
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 主要试剂的配制
•     2.1.3 实验设备
•     2.1.4 实验菌种与培养基
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 P.chrysosporium菌悬液制备及菌体培养
•     2.2.2 P.chrysosporium生长曲线
•     2.2.3 p H对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•     2.2.4 孢子液接种量对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•     2.2.5 葡萄糖初始浓度对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•     2.2.6 TBBPA初始浓度对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•     2.2.7 共存重金属Cd2+对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•     2.2.8 P450酶抑制剂对TBBPA去除的影响
•     2.2.9 TBBPA样品的分析和测定
•     2.2.10 统计分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 P.chrysosporium生长曲线
•     2.3.2 体系p H对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•     2.3.3 碳源浓度对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•     2.3.4 孢子液接种量对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•     2.3.5 污染物初始浓度对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
• 2+对P.chrysosporium去除TBBPA的影响'>    2.3.6 Cd²⁺对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•     2.3.7 P450酶抑制剂对P.chrysosporium去除TBBPA的影响
•   2.4 本章小结
• 第三章 P.chrysosporium降解TBBPA的机理及解毒特性研究
•   3.1 实验材料与仪器
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 主要试剂的配制
•     3.1.3 实验设备
•     3.1.4 实验菌种与培养基
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 TBBPA及其降解产物的提取
•     3.2.2 TBBPA降解产物的分析
•     3.2.3 HepG2细胞培养
•     3.2.4 HepG2细胞染毒
•     3.2.5 HepG2细胞ROS检测
•     3.2.6 HepG2细胞凋亡检测
•     3.2.7 HepG2细胞线粒体膜电位检测
•     3.2.8 HepG2细胞周期检测
•     3.2.9 统计分析
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 P.chrysosporium降解TBBPA的产物分析
•     3.3.2 P.chrysosporium降解TBBPA的路径推导
•     3.3.3 TBBPA及其代谢混合物对HepG2细胞ROS的影响
•     3.3.4 TBBPA及其代谢混合物对HepG2细胞凋亡的影响
•     3.3.5 TBBPA及其代谢混合物对HepG2细胞线粒体膜电位的影响
•     3.3.6 TBBPA及其代谢混合物对HepG2细胞周期的影响
•   3.4 本章小结
• 第四章 P.chrysosporium降解TBBPA过程中的蛋白质组分析
•   4.1 实验材料与仪器
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 主要试剂的配制
•     4.1.3 实验设备
•     4.1.4 菌种与培养基
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 菌体培养与TBBPA暴露
•     4.2.2 蛋白提纯与蛋白纯化
•     4.2.3 蛋白质定量
•     4.2.4 蛋白酶切与iTRAQ标记
•     4.2.5 第一维液高pH-RP液相分离
•     4.2.6 第二维反向液质联用RPLC-MS
•     4.2.7 数据检索
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 蛋白鉴定及差异蛋白定量
•     4.3.2 差异蛋白功能分类
•     4.3.3 特定差异蛋白功能分析
•   4.4 本章小结
• 第五章 TBBPA生物强化降解及对微生物群落的影响
•   5.1 实验材料与仪器
•     5.1.1 实验设备
•     5.1.2 实验材料
•     5.1.3 实验菌种与培养基
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 生物强化降解实验设置
•     5.2.2 TBBPA的提取及测定
•     5.2.3 DNA提取与PCR扩增
•     5.2.4 高通量测序及生物信息分析
•     5.2.5 菌群功能预测
•     5.2.6 统计分析
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 水/沉积物体系中TBBPA的生物强化降解
•     5.3.2 水/沉积物体系中微生物群落多样性分析
•     5.3.3 水/沉积物体系中真菌群落结构分析
•     5.3.4 水/沉积物体系中细菌群落结构分析
•     5.3.5 水/沉积物体系中微生物群落的功能多样性
•   5.4 本章小结
• 结论与展望
•   结论
•   展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈章鸿

导师: 尹华

关键词: 四溴双酚,黄孢原毛平革菌,细胞毒性,蛋白质组学,生物修复

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 华南理工大学

基金: 国家自然科学基金委-广东联合基金重点项目(U1501234)

分类号: X172;X592

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.001007

总页数: 100

文件大小: 4364K

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