八肋游仆虫组织蛋白酶B序列分析和性质研究

论文摘要

组织蛋白酶B（cathepsin B,CTSB）属于木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶家族的一类水解酶,广泛存在于从病毒到哺乳动物和人等生物体内。CTSB催化作用是由半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺三个保守氨基酸组成的催化中心实现。CTSB的结构由信号肽（signal sequence）、前体肽（prosequence）和成熟序列（mature sequence）组成。在成熟序列中,CTSB具有一段额外的插入序列,即封闭环（occluding loop）结构,使得CTSB具有除肽链内切酶以外的羧基二肽酶（外肽酶）活性。八肋游仆虫（Euplotes octoearinatus）是一种淡水纤毛虫,具有核的二态性,即营养大核和一个生殖小核。在翻译水平上,八肋游仆虫中存在高频率的编程性核糖体移码现象和遗传密码子重新分配现象,将UGA作为有义密码子,重新编码为半胱氨酸。目前,对CTSB的研究主要集中于寄生虫和人类肿瘤细胞中,除具有蛋白水解作用外,CTSB还参与免疫逃逸、肿瘤发生等过程。为了研究八肋游仆虫中组织蛋白酶B的生物学功能,本研究对八肋游仆虫中组织蛋白酶B的基因进行了克隆和序列分析,并对其表达产物的性质进行了研究。主要结果如下:1.八肋游仆虫CTSB基因家族的分子克隆和序列分析。以人CTSB的氨基酸序列作为查询序列,在八肋游仆虫的数据库中找到6条编码EoCTSBs的序列。系统进化树分析显示,6条EoCTSBs序列为CTSB的同源序列。之后对6条EoCTSBs基因进行序列分析,发现6种EoCTSBs基因编码的氨基酸数目为290个左右,蛋白大小为32 KD左右,等电点均小于7。氨基酸序列分析表明,6种EoCTSBs具有保守的3个催化活性位点,EoCTSB-1和EoCTSB-2不具有信号肽结构,EoCTSB-3具有催化特异性底物的功能。6种EoCTSBs均不具有封闭环结构。有研究表明,封闭环结构的缺失会造成外肽酶活性的消失,但会增加内肽酶的活性。2.八肋游仆虫EoCTSB-1读框内终止密码子的研究。通过对6条EoCTSBs核酸序列分析,发现在EoCTSB-1的ORF区内存在终止密码子TAA和TAG,通过序列比对结果显示,此处的终止密码子可能是编码氨基酸。为此,本研究从核酸水平和蛋白水平分别对该现象进行验证。在核酸水平部分,本研究利用单细胞PCR技术,以不同采集地的八肋游仆虫为模板,扩增EoCTSB-1基因,结果显示在其他株系的八肋游仆虫EoCTSB-1的ORF区也均存在TAA和TAG密码子。为进一步探讨这个基因是假基因还是编码有功能的蛋白,本研究在证实该基因具有转录活性的基础上,设计制备了EoCTSB-1的特异性抗体,并利用该抗体对八肋游仆虫总蛋白进行免疫印迹实验,免疫荧光实验,脂质体转染实验,均检测到阳性实验结果,初步证明该基因可以编码一个有功能的蛋白。3.八肋游仆虫EoCTSB-1的表达纯化和酶活测定。为了进一步探讨EoCTSB-1性质和功能,本研究在大肠杆菌中成功表达了EoCTSB-1,首先对EoCTSB-1基因进行优化,并构建重组表达质粒pET-30a-EoCTSB-1。将质粒转入E.coli BL21细胞,经IPTG诱导,用镍柱亲和层析纯化,最终获得重组蛋白His-EoCTSB-1。最后,利用荧光底物Z-Phe-Arg-AMC对其酶活进行检测。测得EoCTSB-1的最适温度为35℃,最适pH是5.0。综上所述,本研究在八肋游仆虫数据库中鉴定得到6条EoCTSBs基因,并对6条EoCTSBs进行序列分析,其中EoCTSB-1基因的开放阅读框内存在终止密码子的现象,随后从核酸水平和蛋白水平对该现象进行了研究,初步证明该基因可以编码一个有功能的蛋白。最后构建了重组表达质粒pET-30a-EoCTSB-1,转入E.coli BL21细胞,经镍柱亲和层析获得较高纯度的EoCTSB-1蛋白,利用底物Z-Phe-Arg-AMC对EoCTSB-1的最适温度和最适pH进行了测定,实验结果从另一角度表明EoCTSB-1在体内可能是有功能的。本研究为深入研究八肋游仆虫遗传密码子使用的复杂性奠定基础,也为深入探讨不同的EoCTSB的催化活性及其细胞生物学功能提供实验数据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 八肋游仆虫
•   1.2 组织蛋白酶B
•     1.2.1 组织蛋白酶及分类
•     1.2.2 组织蛋白酶B的合成过程
•     1.2.3 组织蛋白酶B的结构特征
•     1.2.4 组织蛋白酶B的应用前景
•   1.3 密码子的重新分配现象
•   1.4 本课题的研究思路及意义
•     1.4.1 本课题的研究思路
•     1.4.2 本课题的研究意义
• 第二章 八肋游仆虫组织蛋白酶B基因家族的分子克隆及序列分析
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 不同生物组织蛋白酶B基因序列的来源
•     2.1.2 菌株和载体
•     2.1.3 引物、主要酶及分子生物学试剂
•     2.1.4 主要实验试剂的配制
•     2.1.5 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 八肋游仆虫的培养和收集
•     2.2.2 八肋游仆虫组织蛋白酶B基因的鉴定
•     2.2.3 八肋游仆虫基因组的提取
•     2.2.4 八肋游仆虫总RNA的提取
•     2.2.5 八肋游仆虫组织蛋白酶B基因c DNA3′端序列的扩增
•     2.2.6 PCR产物与载体p MD?18-T的连接
•     2.2.6 生物信息学分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 EoCTSBs基因的鉴定
•     2.3.2 EoCTSB的序列和结构特征分析
•     2.3.3 六种组织蛋白酶B基因均具有转录活性
•   2.4 讨论
• 第三章 八肋游仆虫组织蛋白酶B-1读框内终止密码子的研究
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株和载体
•     3.1.2 引物、主要酶及分子生物学试剂
•     3.1.3 主要实验试剂的配制
•     3.1.4 实验仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 PCR扩增
•     3.2.2 EoCTSB-1的c DNA3′端序列的扩增
•     3.2.3 实时荧光定量实验（qPCR）
•     3.2.4 单细胞克隆
•     3.2.5 组织蛋白酶B-1 多克隆抗体的制备
•     3.2.6 细胞免疫荧光实验
•     3.2.7 重组质粒pBTub-Tel-EoCTSB-1 的构建
•     3.2.8 脂质体转染
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 EoCTSB-1 基因全长的克隆、序列分析和转录活性分析
•     3.3.2 组织蛋白酶B-1 多克隆抗体的制备
•     3.3.3 抗体特异性检测和内源性组织蛋白酶B-1 的检测
•     3.3.4 组织蛋白酶B-1 在八肋游仆虫中的免疫荧光实验
•     3.3.5 脂质体转染实验
•   3.4 讨论
• 第四章 八肋游仆虫组织蛋白酶B-1的酶活检测
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 菌株和载体
•     4.1.2 引物、主要酶及分子生物学试剂
•     4.1.3 主要实验试剂的配制
•     4.1.4 实验仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 组织蛋白酶B-1 的蛋白序列的生物信息学分析
•     4.2.2 EoCTSB-1 基因的克隆
•     4.2.3 重组质粒pET-30a-EoCTSB-1的构建
•     4.2.4 EoCTSB-1蛋白的表达和纯化
•     4.2.5 温度对EoCTSB-1活性的影响
•     4.2.6 pH对EoCTSB-1活性的影响
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 组织蛋白酶B-1 氨基酸序列的生物信息学分析
•     4.3.2 重组表达质粒pET-30a-EoCTSB-1 的构建与EoCTSB-1 蛋白的表达纯化
•     4.3.3 温度对EoCTSB-1活性的影响
•     4.3.4 pH对EoCTSB-1活性的影响
•   4.4 讨论
• 总结和展望
• 参考文献
• 附录1 缩略语
• 附录2 常用试剂配制
• 附录3 主要仪器设备
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘婧妮

导师: 梁爱华

关键词: 八肋游仆虫,组织蛋白酶,序列分析,终止密码子

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山西大学

分类号: Q78

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000083

总页数: 83

文件大小: 5309K

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