马、驴、马骡β-防御素1基因克隆、体内表达及原核表达研究

论文摘要

防御素作为机体天然免疫系统的重要组成部分,广泛分布于哺乳动物各种组织器官的上皮细胞中,是一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗菌肽。防御素不仅可以直接抵抗病原微生物,而且还具有免疫调节作用。虽然人们对于大多数哺乳动物β-防御素1的结构、功能及表达等都有所研究,但对于马、驴、马骡的研究鲜有报道。本文根据NCBI公布的马、驴的β-防御素1cDNA保守序列设计引物,通过RT-PCR和cDNA末端快速克隆技术（RACE）获得了马、驴、马骡基因序列。通过RT-qPCR（RealTime QuantitativePCR）检测三种动物各个组织器官（舌、气管、食管、肺、胃底、十二指肠、幽门、空肠、回肠、直肠、结肠、膀胱、肾、脾、脊髓）β-防御素1的表达水平。建立了β-防御素1的原核表达系统,原核表达产物抑菌,为今后防御素生物产业化奠定了理论基础。1.驴、马、马骡β-防御素1基因全长分别为501bp、449bp、474bp。对比UniProtKB数据库中已有的mRNA,发现马、驴、马骡处于同一个进化阶段,确定了马、驴、马骡之间的同源保守性。通过与其他哺乳动物（大鼠、黑猩猩、褐家鼠、猪、山羊、绵羊、狗）氨基酸的对比与进化树的构建,确定了马的β-防御素1在哺乳动物中的进化地位,并找出了由207bp组成的开放读码框（ORF）,该ORF编码69个氨基酸残基,其中包括信号肽（1-22）、前片段（22-33）、以及成熟肽（33-69）,在成熟肽的特定位置含有6个半胱氨酸残基。2.Real-time qPCR方法检测了防御素在马、驴、马骡三种动物不同组织器官中的表达。结果显示防御素在三种动物的各个器官的粘膜层中均有不同程度的表达。驴的幽门部、驴皮以及肾的表达量明显高于其他器官;在马的心、肾、胃底的表达量明显高于其他器官。而与其他器官相比,马骡的胃底、食管、肾的表达量最高。防御素在三种动物消化道及肾表达明显偏高,说明防御素的表达可能与其食性有关。3.利用与类弹性蛋白ELP（Elastin-Like Protein,ELP）共同融合表达方法成功构建了 eBD-1（马β-防御素1）原核表达系统。通过相关软件对合成的eBD-1-ELP的基因进行优化,合成该基因后,将其成功克隆到原核表达载体pET-22b。构建获得了融合重组质粒pET-22b-eBD-1-ELP,通过不同温度及不同浓度IPTG诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE结果显示在37℃、25℃、18℃融合蛋白均能表达,在37℃,IPTG浓度为0.5 mM/L诱导6h,且蛋白纯化缓冲液pH值为8.2时,融合蛋白表达量最高。经过对蛋白进一步纯化、浓缩等成功获得对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用的马β-防御素eBD-1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
•   1.1 防御素的概念及特征
•     1.1.1 防御素的概念
•     1.1.2 防御素的结构特征
•     1.1.3 防御素的分类
•     1.1.4 防御素的作用机理
•   1.2 家畜防御素体内组织表达
•     1.2.1 牛防御素
•     1.2.2 马防御素
•     1.2.3 羊防御素
•     1.2.4 猪防御素
•     1.2.5 鹿防御素
•     1.2.6 骆驼防御素
•   1.3 家畜防御素的体外表达研究
•     1.3.1 原核表达方法
•     1.3.2 真核表达方法
•   1.4 防御素应用前景
•     1.4.1 药用前景
•     1.4.2 饲料添加
•   1.5 ELP简介
•   1.6 本研究的目的及意义
•   1.7 技术路线
• 2 实验一 家畜β-防御素1的克隆与序列分析
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验动物样本采集
•     2.1.2 主要仪器和设备
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 引物设计
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 驴、马、马骡β -防御素1基因中间序列的扩增
•     2.2.2 驴、马、马骡β -防御素1 cDNA全序列扩增及检测
•     2.2.3 实时荧光定量PCR
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 RNA完整性检测
•     2.3.2 RT-PCR产物特异性
•     2.3.3 三种动物β-防御素1RACE扩增结果
•     2.3.4 驴β -防御素1基因RACE产物测序结果
•     2.3.5 马β-防御素1基因RACE产物测序结果
•     2.3.6 马骡β-防御素1基因RACE产物测序结果
•     2.3.7 RACE产物分析
•     2.3.8 不同组织β-防御素1基因表达的差异性分析
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 3 实验二 马β-防御素1原核表达载体的构建及其活性检测
•   3.1 材料
•     3.1.1 实验动物
•     3.1.2 载体和酶
•     3.1.3 主要仪器和设备
•     3.1.4 主要试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 eBD-1目的基因的克隆及序列分析
•     3.2.2 重组原核表达质粒pET-22b-eBD-1-ELP的构建
•     3.2.3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达
•     3.2.4 利用蛋白纯化仪（AKTA pure 25）最佳纯化条件优化
•     3.2.5 目的蛋白活性检测
•   3.3 结果
•     3.3.1 马肾组织RNA提取检测
•     3.3.2 eBD-1基因的克隆与鉴定
•     3.3.3 ELP基因的克隆与鉴定
•     3.3.4 阳性重组工程菌的筛选与鉴定
•     3.3.5 重组eBD-1-ELP基因测序结果及序列分析
•     3.3.6 重组融合eBD-1-ELP蛋白表达条件优化
•     3.3.7 融合蛋白eBD-1-ELP的纯化
•     3.3.8 Western blot检测结果
•     3.3.9 抗菌活性检测
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 魏薇

导师: 曹贵方

关键词: 防御素,马驴马骡,组织表达,原核表达

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 内蒙古农业大学

分类号: S811;Q78

总页数: 81

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