导读:本文包含了随机突变论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:突变,层析,抗体,库克,纳米,脂肪,免疫。
随机突变论文文献综述
姜凤珍,胡斌[1]（2019）在《劳资冲突行为演化的随机突变分析及稳定性》一文中研究指出针对员工群体与组织之间在利益分配过程中冲突行为的演化过程,借助演化博弈理论建立复制动态方程,同时结合突变理论将复制动态方程转化为经典的尖点突变模型,运用突变理论分析员工层面与组织劳资冲突行为的演化过程。在此基础上,在尖点突变模型中加入随机扰动项,解释员工层面与组织在受到随机扰动的情况下对抗行为的演化,并给出对抗事件演化的稳定性分析。最后,给出模型的数值模拟分析。模拟结果表明:员工的边际生产率越高,员工群体层面爆发冲突行为发生突变的可能性越高,员工的边际生产率越低,冲突行为越趋于稳定;员工的努力成本越低,在员工发生对抗事件过程中组织采取强硬措施的可能性越高;对抗事件对员工层面造成的损失越大,冲突事件发生突变的可能性越小。(本文来源于《系统管理学报》期刊2019年05期）
任文洁[2]（2019）在《抗黄曲霉毒素B_1纳米抗体免疫学性能分析及其随机突变库的研究》一文中研究指出黄曲霉毒素B_1(AFB_1)分布广泛,可以致癌、致畸和致突变,且在食品中检出率较高,严重威胁人类和动物的健康。酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术因其特异性强、高通量、简单快速、低成本等优点成为检测黄曲霉毒素的常用方法之一。然而,随着人们对食品安全和质量的要求越来越严格,这两种免疫学分析方法由于其检测灵敏度偏低的局限性,已经无法满足某些实际应用的需求。因此如何提高这两大免疫学检测方法的灵敏度已成为当前亟待解决的主要问题。驼源性纳米抗体作为目前体积最小的基因工程抗体,具有稳定性高、生产周期短、产量高,易于遗传信息改造、成本低等优点,已经被广泛应用于食品安全检测等领域。为了提高酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术的检测灵敏度,本文以驼源性纳米抗体为主要实验材料,紧紧围绕着提高检测信号的灵敏度和改进免疫学元件亲和力两个策略进行了如下研究:1生物素化纳米抗体的制备及应用的研究(策略一:提高检测信号的灵敏度)通过化学生物素法和酶催化生物素法标记纳米抗体,得到了叁种生物素化纳米抗体,即G8-L-Biotin(长臂)、G8-S-Biotin(短臂)和G8-Biotin(酶催化法)。分别建立了基于这叁种抗体的BAS-ELISA(Biotin(strept)avidin system enzyme-linked immunosorbent assay),得到其IC_(50)为7.71 ng/mL(G8-L-Biotin)、3.85 ng/mL(G8-S-Biotin)和1.30 ng/mL(G8-Biotin)。由此可见,基于G8-Biotin建立的BAS-ELISA其灵敏度比基于其它两种抗体建立的方法学(BAS-ELISA)的灵敏度分别提高了6倍和3倍。以G8-Biotin和生物素链霉亲和素系统建立了检测谷物中AFB1的BAS-FLEIA(Biotin(strept)avidin system plus fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay),该方法的半抑制浓度(IC_(50))为0.26 ng/mL,检测限(LOD)为0.03 ng/mL,线性范围(IC_(20)-IC_(80))为0.09-0.74 ng/mL,与其它四种真菌毒素(DON、FB_1、OTA、ZEN)未见有明显的交叉反应,加标回收率为96-112.8%、变异系数为3.28-9.07%。2纳米抗体-纳米荧光素酶(G8-Nluc)的融合表达、活性分析及其应用的研究(策略一:提高检测信号的灵敏度)制备了纳米抗体-纳米荧光素酶(G8-Nluc)融合蛋白,选择CTZ-Native、CTZ-400a和CTZ-H叁种CTZ类似物作为纳米荧光素酶的底物,对G8-Nluc中纳米荧光素酶的活性进行分析,结果显示,纳米荧光素酶具有良好的活性,初始发光强度(RLUmax)的顺序是CTZ-H(2.3×10~6)>CTZ-400a(1.5×10~6)>CTZ-天然(2.5×10~5),与其他两种类似物相比,CTZ-H显示出最强的信号,因此选择CTZ-H作为纳米荧光素酶的最佳反应底物;为了增加反应的最大发光强度和延长反应的半衰期,确定了最佳的缓冲液(pH=8.0,含有1%Tergitol NP-10的10 mM PBS,0.25 mg/mL BSA和8.80 mM EDTA.Na_2),与商业化Glo-lysis和Passive lysis缓冲液相比,该缓冲液配方最大发光强度分别提高了1.50倍和1.80倍,最大发光强度的半衰期延长了2.50倍和9倍,可用于基于纳米荧光素酶及其融合蛋白的高通量免疫测定。以G8-Nluc融合蛋白为检测探针,建立了谷物中AFB_1的一步生物荧光酶联免疫分析法BLEIA(bioluminescent enzyme immunoassay)。该方法的IC_(50)为0.41ng/mL,线性范围为0.10-1.64 ng/mL。基于G8-Nluc融合蛋白的BLEIA的灵敏度比基于G8纳米抗体的经典两步ELISA(IC_(50)=8.14 ng/mL)灵敏度提高约20倍,玉米和燕麦的加标回收率分别为98-113%和91-106%,变异系数分别为2.56-9.47%和4.00-8.25%,与其它四种真菌毒素(DON、FB_1、OTA、ZEN)未见有明显的交叉反应。3基于五价纳米抗体单体的免疫层析检测技术及其应用的研究(策略二+策略一:改进免疫学元件亲和力+提高检测信号的灵敏度)构建了G8-CTB原核表达载体pET25b-CTB-G8,并将其转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,表达纯化后获得了G8-CTB五聚体的单体;采用种子增长法制备花状纳米金(AuNFs)溶液,将G8-CTB与花状纳米金AuNFs(Gold nanoflowers,AuNFs)进行偶联,制备金标探针,通过优化NC膜种类、抗原AFB_1-BSA和金标探针的量,成功研制了检测AFB_1的免疫层析方法,该法裸眼可视检出限为1 ng/mL、检测时间只需10 min,耐受30%甲醇浓度,无需专业人员和仪器,可直接目测其结果,特别适合现场快速检测。4纳米抗体随机突变文库的构建淘选和分析采用易错PCR方法,通过对Mg~(2+)浓度、Mn~(2+)浓度、TritonX-100浓度进行单因素试验,建立了随机突变文库,初步判定该突变文库的阳性率为89%,突变文库的有效库容量为5.96×10~6 cfu,用辅助噬菌体M13K07救援后,突变文库容量为2.10×10~133 cfu/mL,随机挑选10个阳性克隆进行测序分析显示,突变子均为单个基因突变且分布比较均匀。以人工抗原AFB_1-BSA为靶分子进行五轮的固相亲和淘选,经过间接竞争phage-ELISA鉴定,结果显示,突变子5-34活性消失,5-23阳性克隆的灵敏度比野生型的提高了2.10倍,5-21、5-24的灵敏度较野生型的分别降低了6.37倍和10.55倍,5-20、5-22和5-25灵敏度无显着变化。分析测序结果显示,FR2区第45位赖氨酸(45K)突变为精氨酸(45R),第46位的谷氨酸(E)突变为琥珀密码子,可以提高突变子的活性,而FR1区第叁位的谷胱氨酸(3Q)和FR3区第93位的苏氨酸(93T)同时突变则使突变子的活性显着降低甚至消失。(本文来源于《南昌大学》期刊2019-06-30）
郭佳,蒋韵,滕飞,尹衍新,于丽华[3]（2019）在《间质上皮转化因子(c-Met)嵌合抗体重链CDR3随机突变哺乳动物细胞表面展示文库的构建》一文中研究指出目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建间质上皮转化因子(c-Met)嵌合抗体3E1D7的重链补体决定区3(CDR3)随机突变抗体库。方法用定向进化的方法在嵌合抗体3E1D7重链CDR3内部造成基因随机突变,将其通过双酶切克隆到哺乳动物细胞展示载体pSZI-CD中构建随机突变抗体库。抗体库基因转染CHO细胞,流式细胞术检测抗体基因是否在细胞表面表达。结果 3E1D7重链CDR3随机突变抗体库构建成功,库容量达到5.52×10~6。随机挑选20个阳性克隆进行测序鉴定, 20个克隆均在不同位置发生碱基突变且没有重复突变,编码20种不同的氨基酸序列,抗体库具有较好的多样性和随机性。流式细胞术分析抗体基因库上膜情况,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达。结论通过哺乳动物细胞表面展示技术,成功构建了库容量达到5.52×10~6的c-Met嵌合抗体重链CDR3随机突变抗体库。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2019年06期）
房师松[4]（2018）在《甲型流感H5/H7/H9及N2/N6/N9亚型非翻译区随机突变基因库构建及筛选》一文中研究指出目的通过生物信息学方法分析甲型流感病毒H5/H7/H9及N2/N6/N9基因非翻译区(UTR)多态性位点,利用自主改造的RNA聚合酶Ⅰ荧光报告系统为骨架,构建含有H5/H7/H9及N2/N6/N9-UTR随机突变位点的随机突变基因库。从HA/NA-UTR随机突变库中挑选突变株,定性及定量地分析目报告基因表达情况,以此探究UTR多态性位点突变对甲型流感病毒HA/NA基因表达影响。方法1.流感病毒HA/NA基因UTR序列特征分析;2.RNA聚合酶I荧光报告系统的改造;3.H5/H7H9及N2/N6/N9-UTR随机突变基因库构建;4.报告基因上调筛选及鉴定。结果1.系统地分析深圳市及全球H5/H7/H9及N2/N6/N9-UTR序列特征,归纳出UTR序列突变位点特征;2.改造的RNA聚合酶I系统有效驱动报告基因EGFP表达,能以此用作UTR突变的功能性研究;3.成功构建H5/H7/H9及N2/N6/N9-UTR基因突变库,突变库容量达建库要求;4.经检验,实验组H7-10/H9-1/N2-5-UTR突变能显着上调报告基因表达。结论经改造获得不含任何外源性RNA启动子的RNA聚合酶I荧光报告系统,其能有效运用于流感病毒HA/NA-UTR突变研究;成功构建HA/NA-UTR随机突变基因库,库容量均达106 cfu/mL。随机挑选阳性克隆H7-10/H9-1/N2-5 UTR突变能显着上调报告基因的表达。为进一步探究UTR多态性位点对甲型流感病毒HA及NA基因表达,用于流感发生发展机制研究奠定基础。(本文来源于《第九届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文集》期刊2018-09-20）
尹金凤,李泓全,吴欣森[5]（2018）在《产脂肪酶重组菌SRI-01随机突变及诱导表达条件的研究》一文中研究指出采用大引物全质粒法(MEGAWHOP)随机突变,快速有效地对研究室前期构建的一株脂肪酶重组菌株SRI-01进行分子改造,通过对易错聚合酶链反应(ep-PCR)获得的2 300个突变株进行96孔板高通量筛选,得到一株优良突变株SRM08。通过单因素试验,优化诱导前的菌体生物量、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、Ca Cl2的浓度、诱导温度。通过比较3种不同破碎缓冲液浓度和缓冲液p H对脂肪酶活力的影响,选择最优的破碎缓冲液。确定突变株SRM08最佳诱导表达条件为菌液生物量OD600 nm值为0.7,IPTG的浓度为0.1 mmol/L,Ca Cl2浓度为4 mmol/L,诱导温度为25℃,采用5 mmol/L磷酸钠缓冲液为破碎缓冲液,p H值为7.0。在此优化条件下,脂肪酶活达到88 508 U/L,为原重组菌株SRI-01的2.84倍。(本文来源于《中国酿造》期刊2018年08期）
曲雯雯,吴蕾蕾,周顺,史晓翀,张晓华[6]（2018）在《采用随机突变方法对β-琼胶酶YM01-3活性位点的研究》一文中研究指出【背景】琼胶酶是一种多糖水解酶,在保健食品、医药、科研及化妆品等行业极具价值。本实验室发现来源自嗜琼胶卵链菌(Catenovulumagarivorans)的β-琼胶酶YM01-3具有较高的酶活性,在最适条件下的比酶活可达到1.14×10~4U/mg。【目的】探讨不同位点的突变对β-琼胶酶YM01-3酶活力的作用,发现影响其酶活力的新位点。【方法】通过易错PCR在短芽孢杆菌(Bacillus brevis)表达系统中构建随机突变文库,从约10 000个克隆中筛选出227株有效突变体,从中选取80株进行测序。【结果】对突变体序列进行分析和定点突变验证发现,137位和237位氨基酸发生突变后酶活力丧失90%以上。【结论】位于催化腔内的137位和237位氨基酸,对于维持β-琼胶酶YM01-3酶活力具有重要作用。该研究结果为β-琼胶酶的催化机理研究及分子改造提供了借鉴。(本文来源于《微生物学通报》期刊2018年09期）
陈姣[7]（2018）在《利用纳米抗体CDR3随机突变文库研究抗体结构和功能》一文中研究指出单克隆抗体是治疗性蛋白质中数目最大且发展最快的一组。目前已经有70种抗体药物获得临床用药的批准,2017年抗体药物的市场规模突破了千亿美元。到目前为止,不完全统计结果显示有500种治疗性抗体及其衍生物正在临床试验中,主要集中在癌症治疗和自身免疫性疾病。抗体药物的问世为人类攻克一些重大疾病带来了希望,随着应用的深入,大分子的单克隆抗体由于其自身结构方面的问题,一定程度上限制了它们的应用。这个问题大大激发科学家对抗体改造的热情,尤其是抗体小型化的改造。NBL42为本研究组前期发现的一个仅具有CDR3和两侧框架区的纳米抗体。该抗体对溶菌酶具有较高的特异结合活性和显着的酶抑制活性。分析其序列,发现其CDR3长度为17个氨基酸,框架区的一些氨基酸残基与已知的骆驼源的VHH抗体存在差别。因此,设想将纳米抗体NBL42作为模型,用于抗体结构与功能间联系的研究。本研究的目的主要有两方面:首先,利用NBL42-ΔCDR3随机突变文库分析纳米抗体CDR3区氨基酸的分布情况;其次,采用定点突变和移植的方法验证NBL42框架区能否作为突变文库的通用骨架或者CDR移植的框架;为设计文库和抗体的小型化改造提供借鉴,对今后新型抗体的设计提供一定的实验基础。第一部分利用NBL42-ΔCDR3随机突变文库分析纳米抗体CDR3区氨基酸的分布首先采用重迭PCR技术保留NBL42纳米抗体的框架区(FR3-FR4),对其CDR3区的17个氨基酸按照NNY的突变法则进行随机突变。通过基因合成方法获得NBL42-ΔCDR3随机突变DNA片段。构建NBL42-ΔCDR3随机突变文库,库容为4.8×10~7。随后对突变文库采用两种抗原(溶菌酶和CD47重组蛋白)进行多轮筛选。筛选完成之后,采用多克隆Phage ELISA验证文库的富集良好;分别从筛选的最后两轮中随机挑选100个单克隆进行可溶性表达,最终获得3株抗溶菌酶的纳米抗体。将抗体序列亚克隆至表达载体pET22b(+)上,诱导表达纯化获得抗体蛋白,间接ELISA结果显示3株纳米抗体的亲和力较低。为进一步了解纳米抗体CDR3区氨基酸分布情况,我们对未免疫骆驼VHH的1209159条高通量测序的数据进行分析。CDR3区的长度范围为6-33个氨基酸,分别将不同长度的序列进行频数统计,同时统计每一个位点上氨基酸的种类和频数,计算相应的实际频率,再将实际频率与理论频率进行卡方分析,发现CDR3区中的一些位点具有保守性,这些位点多存在于CDR3区的两端,105和106位上多为丙氨酸、107位的氨基酸多为甘氨酸、天冬氨酸、赖氨酸;108位的氨基酸多为精氨酸、脯氨酸、丙氨酸;115和117位上的酪氨酸。对比NBL42-ΔCDR3随机突变文库的CDR3序列,发现突变文库在以上位点的氨基酸分布与天然文库相比具有较大差异,表明突变文库具有功能性的VHH多样性较低。第二部分采用移植和定点突变的方法分析NBL42的框架区首先将从免疫文库中筛选出来的纳米抗体NBL42的FR3和FR4区作为受体,将结合PD1的纳米抗体VHH H5的CDR3区作为供体,合成NBL42-H5 CDR3重组纳米抗体DNA片段,并连接到pET22b表达载体上,进行表达纯化,获得重组纳米抗体;ELISA方法检测其与PD1的结合特性。结果显示:NBL42-H5CDR3成功构建到pET22b(+),成功表达了NBL42-H5 CDR3重组纳米抗体。ELISA结果表明,移植后的抗体NBL42-H5 CDR3具备了VHH H5部分抗原结合活性。同样的方法选择一个短肽CERX(特异性结合SIRPα的多肽),将它的12氨基酸移植进入NBL42的框架中,组成重组肽抗体,并将目的基因构建于pET22b(+)表达载体上。ELISA结果表明,移植后的抗体NBL42-CERX仍然具有很强的抗原结合活性。我们采用定点突变的方法将NBL42纳米抗体第88位的氨基酸突变,基因由南京金斯瑞生物科技公司合成,将目的片段连接到pET22b(+)表达载体上,进行表达纯化,获得纳米抗体NBL42-C88Y。通过ELISA验证该纳米抗体与溶菌酶的结合活性,结果表明,纳米抗体NBL42-C88Y与溶菌酶的结合活性,结果表明,与NBL42相比,C88Y突变的纳米抗体与溶菌酶的结合能力显着降低。(本文来源于《新疆大学》期刊2018-05-20）
陈燕慈[8]（2018）在《甲型流感H5/H7/H9及N2/N6/N9亚型非翻译区随机突变基因库构建及筛选》一文中研究指出目的:通过生物信息学方法分析甲型流感病毒H5/H7/H9及N2/N6/N9亚型非翻译区(UTR)多态性位点,利用自主构建的以EGFP为报告基因的RNA聚合酶I报告系统,构建以RNA聚合酶I荧光报告系统为骨架,含有H5/H7/H9及N2/N6/N9-UTR随机突变位点的随机突变基因库。从HA/NA-UTR随机突变库中挑选突变系统,定性及定量地分析目的报告基因表达情况,以此探究UTR多态性位点突变对甲型流感病毒HA及NA基因表达的影响。方法:1、流感病毒HA/NA基因UTR序列特征分析:2013-2015年间深圳市监测的人感染H5N6,H7N9流感病毒及环境监测H9N2流感病毒进行序列测序。测序结果结合NCBI数据,分析H5/H7/H9及N2/N6/N9-UTR多态性序列特征:利用MEGA软件对各HA/NA-UTR序列构建进化树;利用DNAstar软件对HA/NA-UTR序列进行突变位点分析,获得在自然进化过程中UTR突变位点信息。人为地将各亚型UTR突变位点设计为N碱基(含A、T、C、G),以引物的形式用于构建含UTR随机突变的RNA聚合酶I荧光报告系统;2、RNA聚合酶I荧光报告系统的改造:将RNA聚合酶I人源性启动子PIh、鼠源性终止子t1及Bsmb I酶切位点插入到不含T7启动子的p MD18-T克隆载体中构建RNA聚合酶I元件系统。以A/chicken/Beijing/0309/2013(H9N2)为野生型,将其HA/NA-UTR序列及报告基因EGFP序列克隆至RNA聚合酶I元件系统,并转染至染毒的MDCK细胞。3、H5/H7H9及N2/N6/N9-UTR随机突变基因库构建:将含有N碱基的各亚型HA/NA-UTR序列及报告基因EGFP序列克隆至RNA聚合酶I元件系统,构建H5/H7H9及N2/N6/N9-UTR随机突变基因库,计算基因突变库容量,各亚型随机挑选10个阳性克隆测序。4、报告基因上调筛选及鉴定:经测序鉴定的HA/NA-UTR-RNA聚合酶I荧光报告系统转染至染毒的MDCK细胞,通过荧光显微镜观察报告基因EGFP表达、多功能酶标仪测定报告基因EGFP的相对荧光值及RT-PCR检验报告基因EGFP的相对表达量,筛选出导致报告基因上调的HA/NA-UTR突变序列,分析其序列特征,探讨UTR多态性位点突变对甲型流感病毒HA及NA基因表达的影响。结果:1、系统地分析了深圳市及全球H5/H7/H9及N2/N6/N9-UTR序列特征,归纳出UTR序列突变位点特征;2、经验证,构建的RNA聚合酶I系统能有效驱动报告基因EGFP的表达,能以此作为RNA聚合酶I荧光报告系统用于UTR突变的功能性研究;3、成功构建H5/H7/H9及N2/N6/N9-UTR基因突变库,突变库容量达建库要求;4、经检验,实验组H7-10/H9-1/N2-5的UTR突变能显着上调报告基因的表达,分析显着上调的UTR突变可知:突变以嘌呤-嘧啶为主(64.3%),嘌呤-嘧啶突变中A-T为最常见突变(38.9%)。结论:成功构建出不含任何外源性RNA启动子的RNA聚合酶I荧光报告系统,其能有效地运用于流感病毒HA/NA-UTR突变功能研究;成功构建出HA/NA-UTR随机突变基因库,库容量均达106 cfu/m L。随机挑选的阳性克隆H7-10/H9-1/N2-5 UTR突变能显着上调报告基因的表达。为进一步探究UTR多态性位点对甲型流感病毒HA及NA基因表达,包装出HA/NA高表达的甲型流感子代病毒用于流感发生发展机制研究奠定基础。(本文来源于《暨南大学》期刊2018-04-19）
张茂峰[9]（2018）在《基于随机突变体构建的克罗诺杆菌逆境相关基因的发掘研究》一文中研究指出克罗诺杆菌是一种兼性厌氧革兰氏阴性菌,通常以婴幼儿配方奶粉为主要感染渠道,对婴幼儿的身体健康造成严重危害。该菌可引起新生儿细菌性脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症等,且致死率高达40%-80%。克罗诺杆菌分布广泛且严重危害某些特定人群(如新生儿)生命而被广泛关注。克罗诺杆菌的抗逆性很强,而目前对克罗诺杆菌抗逆性的相关基因研究鲜有报道。本课题以丙二酸盐克罗诺杆菌野生株为主要研究对象,通过质粒结合转移的方法构建克罗诺杆菌的突变体库。基于突变株和野生株在不同逆境胁迫下(渗透压胁迫、氧化应激胁迫、干燥胁迫、酸胁迫)生长情况,筛选出具有代表性的不同逆境耐受突变株;通过随机PCR反应及数据库比对确定其突变位点。在此基础上,开展结晶紫染色测量突变株和野生株生物膜形成能力实验研究,并借助激光共聚焦和扫描电子显微镜表征逆境胁迫下野生株和突变株的生物膜微观变化。结果表明,1.渗透压胁迫相关因子包括:内膜蛋白Yhj D、钾离子外流蛋白Kef A、肽基辅氨酰异构酶、半胱氨酸-t RNA复合结构脱酰基酶、寡聚半乳酸裂解酶;2.干燥胁迫相关因子包括:葡萄糖-6-磷酸异构酶、糖基水解酶、海藻糖-6-磷酸合酶、外膜蛋白A、碳磷裂解酶复合物亚基团;3.氧化应激胁迫相关因子包括:泛酰酸激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、丙酮酸激酶、磷脂酶A、丙氨酸消旋酶2、铁离子转运蛋白A、硫氧还蛋白2和谷氧还蛋白3;4.酸胁迫相关基因包括:葡萄糖基转移酶Mdo H、胞外丝氨酸蛋白酶、硫酸盐转运体、磷酸盐转运体亚基,并且我们发现除了糖基水解酶之外,其他突变株生物膜形成较野生株均为显着下降,可见,克罗诺杆菌通过产生生物膜增强自身在逆境条件下的存活能力,研究结果为探究克罗诺杆菌抗逆性机制提供了基础理论数据,对预防和控制食品加工过程中的克罗诺杆菌的污染具有重要意义。(本文来源于《合肥工业大学》期刊2018-03-01）
陈正涛,王秀臻,王方昆,李宏梅,赵孝民[10]（2017）在《应用基因随机突变提高鸡柔嫩艾美尔球虫EtMIC2蛋白质免疫原性的研究》一文中研究指出定向进化技术作为开发鉴定新型变体蛋白的有效工具被广泛应用于蛋白质工程领域,改善抗原的免疫原性是定性进化技术的重要应用之一,其中使用随机突变构建基因突变库是定向进化技术的常用方法。Et MIC2蛋白是鸡柔嫩艾美尔球虫的重要候选疫苗分子之一,在球虫的整个生活周期内都表达,但研究表明Et MIC2蛋白仅能诱导部分免疫保护力。本研究旨在通过定向进化中的随机突变技术提高Et MIC2蛋白的免疫原性,为柔嫩艾美尔球虫的防控提供基础,并为其他寄生虫及病原的防控提供借鉴。研究采用随机突变技术ep PCR构建Et MIC2基因突变库,酵母表面展示技术展示变体蛋白库,通过Et MIC2多克隆抗体运用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting techniques,FACS)筛选高免疫原性Et MIC2变体蛋白,对筛选出的蛋白进行原核表达并制备亚单位疫苗,通过动物实验评估其免疫原性及免疫保护力。结果显示:约107 Et MIC2基因突变库构建成功,Et MIC2突变蛋白库成功展示于酵母表面,FACS技术筛选出7株具有高反应原性的变体蛋白;动物实验结果显示,与Et MIC2天然蛋白免疫组相比,1130及2119变体蛋白免疫组的体重增长显着增高、卵囊排出及盲肠病变积分均显着降低(P<0.05),ACI指数分别高达172.48和167.21,显着高于Et MIC2天然蛋白组137.92(P<0.05),且血液中淋巴细胞增殖水平显着升高(P<0.05)。研究表明,通过随机突变技术成功获得两株(1130,2119)具有高免疫原性及免疫保护力的Et MIC2变体蛋白,研究证明采用定向突变技术提高寄生虫抗原的免疫原性及保护力是有效可行的。(本文来源于《中国动物学会寄生虫学专业委员会第十六次全国学术会议暨第七次国际寄生虫学学术研讨会论文摘要集》期刊2017-10-13）
随机突变论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
黄曲霉毒素B_1(AFB_1)分布广泛,可以致癌、致畸和致突变,且在食品中检出率较高,严重威胁人类和动物的健康。酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术因其特异性强、高通量、简单快速、低成本等优点成为检测黄曲霉毒素的常用方法之一。然而,随着人们对食品安全和质量的要求越来越严格,这两种免疫学分析方法由于其检测灵敏度偏低的局限性,已经无法满足某些实际应用的需求。因此如何提高这两大免疫学检测方法的灵敏度已成为当前亟待解决的主要问题。驼源性纳米抗体作为目前体积最小的基因工程抗体,具有稳定性高、生产周期短、产量高,易于遗传信息改造、成本低等优点,已经被广泛应用于食品安全检测等领域。为了提高酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术的检测灵敏度,本文以驼源性纳米抗体为主要实验材料,紧紧围绕着提高检测信号的灵敏度和改进免疫学元件亲和力两个策略进行了如下研究:1生物素化纳米抗体的制备及应用的研究(策略一:提高检测信号的灵敏度)通过化学生物素法和酶催化生物素法标记纳米抗体,得到了叁种生物素化纳米抗体,即G8-L-Biotin(长臂)、G8-S-Biotin(短臂)和G8-Biotin(酶催化法)。分别建立了基于这叁种抗体的BAS-ELISA(Biotin(strept)avidin system enzyme-linked immunosorbent assay),得到其IC_(50)为7.71 ng/mL(G8-L-Biotin)、3.85 ng/mL(G8-S-Biotin)和1.30 ng/mL(G8-Biotin)。由此可见,基于G8-Biotin建立的BAS-ELISA其灵敏度比基于其它两种抗体建立的方法学(BAS-ELISA)的灵敏度分别提高了6倍和3倍。以G8-Biotin和生物素链霉亲和素系统建立了检测谷物中AFB1的BAS-FLEIA(Biotin(strept)avidin system plus fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay),该方法的半抑制浓度(IC_(50))为0.26 ng/mL,检测限(LOD)为0.03 ng/mL,线性范围(IC_(20)-IC_(80))为0.09-0.74 ng/mL,与其它四种真菌毒素(DON、FB_1、OTA、ZEN)未见有明显的交叉反应,加标回收率为96-112.8%、变异系数为3.28-9.07%。2纳米抗体-纳米荧光素酶(G8-Nluc)的融合表达、活性分析及其应用的研究(策略一:提高检测信号的灵敏度)制备了纳米抗体-纳米荧光素酶(G8-Nluc)融合蛋白,选择CTZ-Native、CTZ-400a和CTZ-H叁种CTZ类似物作为纳米荧光素酶的底物,对G8-Nluc中纳米荧光素酶的活性进行分析,结果显示,纳米荧光素酶具有良好的活性,初始发光强度(RLUmax)的顺序是CTZ-H(2.3×10~6)>CTZ-400a(1.5×10~6)>CTZ-天然(2.5×10~5),与其他两种类似物相比,CTZ-H显示出最强的信号,因此选择CTZ-H作为纳米荧光素酶的最佳反应底物;为了增加反应的最大发光强度和延长反应的半衰期,确定了最佳的缓冲液(pH=8.0,含有1%Tergitol NP-10的10 mM PBS,0.25 mg/mL BSA和8.80 mM EDTA.Na_2),与商业化Glo-lysis和Passive lysis缓冲液相比,该缓冲液配方最大发光强度分别提高了1.50倍和1.80倍,最大发光强度的半衰期延长了2.50倍和9倍,可用于基于纳米荧光素酶及其融合蛋白的高通量免疫测定。以G8-Nluc融合蛋白为检测探针,建立了谷物中AFB_1的一步生物荧光酶联免疫分析法BLEIA(bioluminescent enzyme immunoassay)。该方法的IC_(50)为0.41ng/mL,线性范围为0.10-1.64 ng/mL。基于G8-Nluc融合蛋白的BLEIA的灵敏度比基于G8纳米抗体的经典两步ELISA(IC_(50)=8.14 ng/mL)灵敏度提高约20倍,玉米和燕麦的加标回收率分别为98-113%和91-106%,变异系数分别为2.56-9.47%和4.00-8.25%,与其它四种真菌毒素(DON、FB_1、OTA、ZEN)未见有明显的交叉反应。3基于五价纳米抗体单体的免疫层析检测技术及其应用的研究(策略二+策略一:改进免疫学元件亲和力+提高检测信号的灵敏度)构建了G8-CTB原核表达载体pET25b-CTB-G8,并将其转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,表达纯化后获得了G8-CTB五聚体的单体;采用种子增长法制备花状纳米金(AuNFs)溶液,将G8-CTB与花状纳米金AuNFs(Gold nanoflowers,AuNFs)进行偶联,制备金标探针,通过优化NC膜种类、抗原AFB_1-BSA和金标探针的量,成功研制了检测AFB_1的免疫层析方法,该法裸眼可视检出限为1 ng/mL、检测时间只需10 min,耐受30%甲醇浓度,无需专业人员和仪器,可直接目测其结果,特别适合现场快速检测。4纳米抗体随机突变文库的构建淘选和分析采用易错PCR方法,通过对Mg~(2+)浓度、Mn~(2+)浓度、TritonX-100浓度进行单因素试验,建立了随机突变文库,初步判定该突变文库的阳性率为89%,突变文库的有效库容量为5.96×10~6 cfu,用辅助噬菌体M13K07救援后,突变文库容量为2.10×10~133 cfu/mL,随机挑选10个阳性克隆进行测序分析显示,突变子均为单个基因突变且分布比较均匀。以人工抗原AFB_1-BSA为靶分子进行五轮的固相亲和淘选,经过间接竞争phage-ELISA鉴定,结果显示,突变子5-34活性消失,5-23阳性克隆的灵敏度比野生型的提高了2.10倍,5-21、5-24的灵敏度较野生型的分别降低了6.37倍和10.55倍,5-20、5-22和5-25灵敏度无显着变化。分析测序结果显示,FR2区第45位赖氨酸(45K)突变为精氨酸(45R),第46位的谷氨酸(E)突变为琥珀密码子,可以提高突变子的活性,而FR1区第叁位的谷胱氨酸(3Q)和FR3区第93位的苏氨酸(93T)同时突变则使突变子的活性显着降低甚至消失。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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