小金海棠转录因子MxMYB176与其上游启动子响应干旱胁迫研究

论文摘要

本文通过对小金海棠转录因子MxMYB176在干旱胁迫下的功能研究以及该基因上游启动子的结构和功能分析,以探究转录因子MxMYB176响应干旱胁迫的分子机理,取得如下的研究结果:提取小金海棠根系总RNA,进行半定量PCR,发现干旱胁迫下MxMYB176转录因子的表达量显著增强。与野生型拟南芥相比,转MxMYB176基因的拟南芥在含有300 mmol/L甘露醇的培养基中的长势较好,转基因株系的主根长是WT的1.84倍。在干旱胁迫下转1300-MYB176拟南芥体内的丙二醛（Malonic Dialdehyde,MDA）含量明显低于转空载（1300）和野生型（WT）拟南芥;脯氨酸大量积累;H2O2的含量明显低于转空载（1300）和野生型（WT）拟南芥;超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）酶活性显著高于转空载（1300）和野生型（WT）拟南芥;花青素和类胡萝素含量也显著高于转空载（1300）和野生型（WT）拟南芥;叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素均显著增加,但叶绿素a/叶绿素b没有明显变化。结果表明,转入小金海棠MxMYB176基因能明显提高拟南芥的抗旱性。利用PCR扩增克隆得到长为1275 bp小金海棠MxMYB176转录因子上游启动子pF,应用在线软件进行生物信息学分析;结果表明,MxMYB176基因启动子上包含有光敏元件、响应脱落酸诱导、受茉莉酸诱导、受低温诱导、受赤霉素诱导、GBF3转录因子绑定位点等多种顺式作用元件。成功构建p9::GUS（950bp）、p6::GUS（653bp）、p3::GUS（313bp）三个5′端不同片段缺失的植物表达载体,通过转化农杆菌,注射烟草进行瞬时表达分析发现,融合不同片段大小启动子驱动的GUS基因的表达强弱依次为pF>p9>p6>p3,其中p3片段中GUS基因几乎不表达。将不同片段启动子转化拟南芥分析其稳定表达,发现随着删切片段的增加MxMYB176启动子活性减弱,全长启动子pF的GUS蛋白酶的活性为0.0303 nM·Min-1·μg-1分别是p9、p6、p3的1.8、5.3、24.1倍,在植株中的稳定表达呈现出与瞬时表达一致的趋势,且在转p6片段启动子的植物中MxMYB176启动子在绿色组织中的活性明显减弱,在转p3片段的启动子植株中只在拟南芥根系有微弱的GUS基因表达而在的叶片上未观察到有GUS基因的表达。由此推断MxMYB176启动子响应胁迫应答的核心区域在-950 bp--653 bp之间。通过对不同甘露醇浓度梯度处理转pF::GUS的拟南芥发现,pF启动子活性随着甘露醇浓度的增加启动子活性增强,在300 mmol/L甘露醇处理下启动子活性最强,是对照（未添加甘露醇）的1.67倍;转不同删切片段启动子的拟南芥用300 mmol/L甘露醇处理,发现不同片段启动子pF、p9、p6、p3的GUS蛋白酶的活性与对照（未添加甘露醇）相比,分别增加了0.69、0.90、0.26、0.84倍。结果表明,在甘露醇处理下MxMYB176启动子活性显著增强（p<0.05）,预测该转录因子在干旱胁迫诱导表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 立题依据
•   1.2 文献综述
•     1.2.1 植物响应干旱胁迫研究综述
•     1.2.2 植物启动子研究综述
•     1.2.3 MYB转录因子
•   1.3 研究方案
•     1.3.1 研究目的
•     1.3.2 研究内容
•     1.3.3 技术路线图
• 第二章 小金海棠转录因子MxMYB176 响应干旱胁迫研究
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料及其培养
•     2.1.2 实验仪器
•     2.1.3 实验试剂及溶液配制
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 引物设计
•     2.2.2 小金海棠RNA提取
•     2.2.3 cDNA的合成
•     2.2.4 转基因拟南芥干旱胁迫处理
•     2.2.5 离体叶片失水率测定
•     2.2.6 脯氨酸测定
•     2.2.7 丙二醛测定
•     2.2.8 DAB和 NBT染色
•     2.2.9 花青素测定
•     2.2.10 叶绿素及类胡萝卜素含量测定
•   2.3 试验结果
•     2.3.1 干旱胁迫下小金海棠MxMYB176 基因表达分析
•     2.3.2 转基因拟南芥表型分析
•     2.3.3 离体叶片失水率测定
•     2.3.4 干旱胁迫下抗性指标测定
•   2.4 讨论
• 第三章 MxMYB176 全长启动子及其5′端缺失片段的克隆与功能分析
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 植物材料及培养
•     3.1.2 菌株及载体
•     3.1.3 实验仪器
•     3.1.4 实验试剂及溶液配制
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 启动子序列的生物信息学分析
•     3.2.2 引物设计
•     3.2.3 MxMYB176 基因启动子及其缺失片段克隆
•     3.2.4 MxMYB176 基因启动子及其缺失片段凝胶回收
•     3.2.5 质粒提取
•     3.2.6 载体线性化
•     3.2.7 表达载体构建
•     3.2.8 热激转化大肠杆菌
•     3.2.9 DNA序列测定
•     3.2.10 农杆菌感受态制备
•     3.2.11 转化农杆菌及菌株鉴定
•     3.2.12 GUS定性分析
•     3.2.13 转基因拟南芥的获得
•     3.2.14 转基因拟南芥的干旱胁迫处理
•     3.2.15 GUS定量检测
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 小金海棠MxMYB176 基因启动子克隆
•     3.3.2 小金海棠MxMYB176 基因启动子分析
•     3.3.3 MxMYB176 基因启动子及其缺失片段的删切
•     3.3.4 MxMYB176 基因启动子缺失片段克隆
•     3.3.5 不同片段大小pMxMYB176::GUS载体构建
•     3.3.6 重组载体转化农杆菌
•     3.3.7 不同片段大小的pMxMYB176::GUS瞬时表达分析
•     3.3.8 转基因拟南芥的获得
•     3.3.9 全长pMxMYB176::GUS的时空表达活性分析
•     3.3.10 转MxMYB176 启动子拟南芥干旱胁迫下的活性分析
•     3.3.11 不同长度片段启动子受到干旱胁迫时的活性分析
•   3.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 康杰

导师: 肖海华

关键词: 小金海棠,干旱胁迫,启动子,功能分析

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 四川农业大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000172

总页数: 83

文件大小: 2817k

下载量: 6