论文摘要
木质纤维素的微生物酶水解是全球碳循环和生物质利用的关键步骤。丝状真菌中纤维素降解酶的合成受到转录水平的严格调控。组蛋白甲基化修饰是染色质调控的重要形式,是真核细胞基因转录调控的关键因素。探索组蛋白修饰在纤维素降解真菌中的生物学功能,将有助于发掘影响纤维素酶合成的新的关键调控因子,全面地阐明纤维素酶合成的调控网络,为构建高产纤维素酶菌株提供遗传改造的合理靶点。本论文以重要的纤维素酶生产真菌草酸青霉为研究对象,通过表观遗传学的研究方法,聚焦于几种典型的组蛋白甲基转移酶的生物学功能研究,确认草酸青霉纤维素酶产生与组蛋白甲基化修饰之间的关联,并对组蛋白甲基化调控糖苷水解酶基因表达的机制进行了探究。本论文的主要研究结果如下:1.组蛋白甲基转移酶LaeA在草酸青霉纤维素酶和β-木糖苷酶合成中具有相反的调控功能。通过比较四株突变株ΔlaeA（laeA敲除菌株）、OEclrBΔlaeA（clrB过表达laeA敲除菌株）、OExlnRΔlaeA（xlnR过表达laeA敲除菌株）和ΔcreAΔlaeA（creA和laeA双敲除菌株）与各自的出发菌株WT（野生型）、OEclrB（clrB过表达菌株）、OExlnR（xlnR过表达菌株）和ΔcreA（creA敲除菌株）中的糖苷水解酶的组成和基因表达的差异,发现LaeA的缺失引起糖苷水解酶基因表达的广泛下调。在LaeA缺失的背景下,分泌组鉴定中含量最高的前10个糖苷水解酶的编码基因（amy15A、amy13A、cel7A/cbh1、cel61A、chil 8A、cel3A/bgl1、xyn10A、cel7B/eg1、cel5B/eg2和cel6A/cbh2）的表达显著下调。转录激活因子ClrB和XlnR的过表达并不能挽救由于LaeA缺失所造成的纤维素酶基因表达和纤维素酶合成的损伤,表明LaeA对于受ClrB和XlnR激活的纤维素酶基因表达是必需的。虽然大部分糖苷水解酶的合成受LaeA正向调控,但是胞外β-木糖苷酶的合成受LaeA负调控。与野生型菌株相比,OExlnRΔlaeA的胞外β-木糖苷酶活性提高5.8倍,最主要的β-木糖苷酶编码基因xyl3A的表达被显著激活。LaeA缺失和转录因子XlnR激活的累加效应是β-木糖苷酶高水平合成的根本原因。2.H3K79位点的组蛋白甲基转移酶PoDot1是草酸青霉无性发育和糖苷水解酶合成的正调控因子。鉴定了草酸青霉中以组蛋白H3第79位赖氨酸位点（H3K79）为靶点的组蛋白甲基转移酶PoDot1,并明确了其在无性孢子发育、营养生长和糖苷水解酶合成中的关键作用。PoDot1通过控制无性发育中关键因子的转录影响孢子发生:Podot1的缺失引起无性发育相关的3个关键调节因子brlA、stuA和flbC的转录水平下调,导致分生孢子的数量减少和孢子发生起始的延迟。PoDot1通过干扰隔膜和分支形成影响菌丝形态:Podot1的缺失引起5个隔膜蛋白编码基因aspA、aspB、aspC、aspD和aspE的表达一致下调,菌丝内的隔膜间距增大,菌丝分支减少。PoDot1调控主要胞外糖苷水解酶基因的表达:PoDot1的缺失导致糖苷水解酶基因的转录下调,胞外淀粉酶和主要纤维素酶的合成减少。推测PoDot1通过影响关键转录因子的表达和H3K79位点的甲基化修饰调控草酸青霉糖苷水解酶的合成:ΔPodot1菌株中,creA的表达上调可能促进纤维素酶的合成减少,amyR的表达下调促进淀粉酶的合成减少;通过Western blot和ChIP-qPCR对细胞内整体组蛋白和特定基因位点组蛋白的甲基化修饰的检测发现,H3K79me2的减少是造成糖苷水解酶的合成缺陷的关键因素。3.H3K36位点的组蛋白甲基转移酶PoSet2是草酸青霉糖苷水解酶合成的负调控因子。确认了纤维素酶合成与组蛋白H3K4和H3K36位点甲基化修饰的关联性:纤维素酶基因的诱导表达伴随着H3K4甲基化的增强和H3K36甲基化的减弱,推测H3K4甲基化是纤维素酶基因表达的激活标记,H3K36甲基化是纤维素酶基因表达的抑制性标记。鉴定了酿酒酵母的H3K36位点的组蛋白甲基转移酶Set2在草酸青霉中的同源蛋白——PoSet2,研究了 PoSet2在草酸青霉中的生物学功能。PoSet2的缺失导致菌株无性发育的延迟,引起纤维素降解酶编码基因转录的广泛激活和纤维素降解酶合成的上调。通过RT-qPCR、Western blot和ChIP-qPCR等试验研究发现,PoSet2缺失菌株中纤维素降解酶基因的激活不是由转录因子ClrB、XlnR、AmyR或CreA介导,而是伴随重要的纤维素降解酶编码基因位点组蛋白的H3K4me3的增强和H3K36甲基化修饰的减弱,推测PoSet2缺失间接影响了COMPASS复合物对H3K4位点的甲基化修饰。结果表明,PoSet2是纤维素降解酶合成的负调控因子,可作为遗传改造以提高纤维素降解酶合成的潜在靶标。4.草酸青霉中H3K4位点的甲基化由组蛋白甲基转移酶PoSet1和PoAsh1共同负责,二者具有功能上的分化。鉴定了草酸青霉中负责H3K4位点甲基化的两个组蛋白甲基转移酶PoSet1和PoAsh1,发现它们在功能上的分化:PoSet1主要负责整体水平的H3K4me1和H3K4me2以及特定纤维素酶基因位点的H3K4me3,而PoAsh1主要负责H3K4me3。PoSet1的敲除导致无性孢子数量和纤维素酶分泌的显著减少。敲除株中纤维素酶活力的下降伴随全局水平H3K4me1和H3K4me2的减少;重要纤维素酶编码基因转录水平的显著下调伴随着基因特定区域H3K4me3的减少;串联亲和纯化-质谱（TAP-MS）的结果表明,PoSet1通过PoSet1、COMPASS的亚基、RNA PolⅡ的亚基以及通用转录因子之间的相互作用参与转录起始。确认由PoSet1介导的H3K4位点的甲基化修饰是纤维素酶合成激活的标记。PoAsh1并非无性孢子发生所必需,PoAsh1的敲除使孢子产量更加丰富;PoAsh1通过影响H3K4me3正向参与纤维素酶基因的表达调控:PoAsh1敲除株中H3K4me3水平的下调伴随着纤维素酶合成的轻微下调。因此,PoSet1和PoAsh1均为纤维素酶合成的正调控因子,但具有不同的影响力。5.PoSet2、PoSet1和PoAsh1通过影响H3K4和H3K36位点的甲基化修饰,协同调控草酸青霉纤维素降解酶基因的表达。发现PoSet2（H3K36）对纤维素酶的负调控效应依赖于PoSet1,但不依赖PoAsh1:ΔPoset2菌株中纤维素酶表达的激活效应和在ΔPoset1ΔPoset2菌株中被消除,并伴随着纤维素酶的合成被抑制和H3K4甲基化修饰的减少;ΔPoset2菌株中纤维素酶合成的上调效应在ΔPoset2APoash1菌株中未被消除,双敲除菌株中纤维素酶的合成能力为Poset2和Poash1分别单独敲除的效应的累加。H3K4和H3K36的甲基化之间存在串扰（crosstalk）:PoSet2通过抑制PoSet1-H3K4me3通路抑制纤维素酶基因的转录。H3K4和H3K36甲基化的平衡是纤维素降解酶基因的正常转录所必需的。PoSet2、PoSet1和PoAsh1通过影响H3K4和H3K36位点的甲基化修饰,协同调控草酸青霉纤维素降解酶基因的表达。最终,我们建立了PoSet2、PoSet1和PoAsh1协同调控草酸青霉纤维素酶基因表达的机制模型:PoSet1是负责H3K4me1和H3K4me2的主要组蛋白甲基转移酶。PoSet1 通过与其他COMPASS亚基（即Swd1,Swd2,Swd3,Bre2,Sdc1,Spp1和Sgh1）、RNA PolⅡ和通用转录因子如TFIID的相互作用,偏向结合靶基因的核心启动子区。H3K4的甲基化是纤维素降解酶基因转录起始的活性标记。PoSet2是负责H3K36位点的甲基转移酶,协调编码区的转录延伸。H3K36的甲基化是纤维素降解酶基因转录的抑制标记。甲基化的H3K36招募抑制性的Rpd3S复合物,促进组蛋白尾部去乙酰化。PoSet2通过对COMPASS亚基的表达和功能的负调控效应来拮抗PoSet1-H3K4me3通路。H3K36和H3K4甲基化的平衡是纤维素降解酶基因的正常转录所必需的。PoAsh1是另一种针对H3K4位点的组蛋白甲基转移酶,主要负责H3K4me3。另外存在负责H3K36甲基化的其它甲基转移酶。当PoSet1和PoSe2缺失后,尽管H3K4和H3K36的甲基化仍可进行,但并不能激活转录。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 李亚楠
导师: 赵建,秦玉琪
关键词: 草酸青霉,纤维素降解酶,组蛋白甲基转移酶
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 山东大学
分类号: Q933
总页数: 185
文件大小: 14737K
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标签：草酸青霉论文; 纤维素降解酶论文; 组蛋白甲基转移酶论文;