米黑根毛霉脂肪酶在蛋白酶缺陷型PichiaPink系统中的表达

论文摘要

米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase,RML）由于其高度的1,3位置催化专一性,使其在造纸、食品、皮革生产、生物柴油等多个行业应用广泛。巴斯德毕赤酵母表达系统兼具了原核生物表达系统表达周期短、表达量较高、易于工业化高密度培养的优点以及真核表达系统对外源蛋白进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰的特点,被认为是一种表达大规模蛋白的强有力工具。但在表达RML时,未经优化的毕赤酵母存在两个缺陷:（1）RML的分泌表达及表面展示都存在被酵母液泡蛋白酶降解的问题,同时毕赤酵母高密度发酵加剧了这一现象;（2）分泌或表面展示的RML酶活均不高,未能达到工业化生产需求。基于此,本文以商业化的蛋白酶缺陷型毕赤酵母作为宿主细胞,有效改善RML被降解的问题,并通过基因工程的手段从信号肽、锚定蛋白等方法进一步提高其分泌量和展示量,为其理论研究奠定夯实的基础。具体研究内容及结果如下:（1）本文利用SignalP4.1在线预测软件,预测出9种D值超过0.7的毕赤酵母内源信号肽:FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9,同时筛选8种常用的毕赤酵母外源信号肽,以广泛应用的α-交配因子（α-mating factor,α-MF）信号肽为对照,考察这些信号肽对增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）和RML在PichiaPink表达系统的分泌效果。结果发现:内源信号肽FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介导EGFP分泌,且PRY2介导EGFP的分泌水平最高,是α-MF的2.15倍;内源信号肽FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介导RML的分泌,且FLO10介导RML的分泌水平最高,是α-MF的1.50倍;外源信号肽对EGFP和RML的分泌效果均没有α-MF好。（2）以毕赤酵母GPI型细胞壁蛋白GCW21为锚定蛋白,实现了脂肪酶RML在蛋白酶缺陷型PichiaPink表达系统中的表面展示,筛选到一株含pPink-HC高拷贝质粒的蛋白酶A缺陷型菌株GS115-ade2△-pep4△/pPink-HC-RML-GCW21,摇瓶发酵水平脂肪酶活力最高,达到121.72 U/g,比未敲除蛋白酶菌株GS115-ade2/pPink-HC-RML-GCW21提高约51.35%,比实验室构建的GS115/PHKA-RML-GCW21提高约46.7%。表面展示RML的最适的反应底物是C8、最适温度为45℃、最适pH为8.0;同时发现Li+、Na+、k+、Mg2+等金属离子对RML酶活力有一定的激活作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一章 绪论
•   1.1 脂肪酶简介
•     1.1.1 脂肪酶定义
•     1.1.2 脂肪酶的来源与分类
•     1.1.3 脂肪酶的结构特点与催化机理
•     1.1.4 脂肪酶的工业应用
•   1.2 米黑根毛霉脂肪酶
•     1.2.1 米黑根毛霉脂肪酶简介
•     1.2.2 米黑根毛霉脂肪酶的应用
•     1.2.3 米黑根毛霉脂肪酶的研究进展
•   1.3 毕赤酵母表达系统
•     1.3.1 毕赤酵母表达系统的优势
•     1.3.2 毕赤酵母高效表达外源蛋白策略
•     1.3.3 毕赤酵母中信号肽的研究
•   1.4 毕赤酵母蛋白酶
•     1.4.1 毕赤酵母蛋白酶分类
•     1.4.2 毕赤酵母液泡蛋白酶分类
•   1.5 本课题研究的意义和内容
•     1.5.1 本课题的研究意义
•     1.5.2 本课题的研究内容
• 第二章 米黑根毛霉脂肪酶RML最适信号肽筛选
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 菌株和质粒
•     2.2.2 主要仪器与设备
•     2.2.3 主要分子克隆用酶及试剂
•     2.2.4 溶液的配制
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 菌株的培养和保存方法
•     2.3.2 信号肽的筛选
•     2.3.3 分泌型重组质粒的构建
•     2.3.4 重组蛋白酶缺陷型毕赤酵母构建
•     2.3.5 目的基因拷贝数的测定
•     2.3.6 重组蛋白酶缺陷型毕赤酵母菌株摇瓶诱导发酵
•     2.3.7 脂肪酶酶活测定方法——pNPB法
•     2.3.8 重组蛋白SDS-PAGE和蛋白浓度分析
•     2.3.9 数据统计分析
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 信号肽预测结果
•     2.4.2 重组质粒的构建以及重组毕赤酵母鉴定
•     2.4.3 目的基因拷贝数的测定
•     2.4.4 信号肽介导EGFP分泌表达
•     2.4.5 信号肽介导RML分泌表达
•   2.5 本章小结
• 第三章 RML在蛋白酶缺陷型毕赤酵母的表面展示及酶学性质分析
•   3.1 引言
•   3.2 材料与仪器
•     3.2.1 菌株和质粒
•     3.2.2 主要仪器
•     3.2.3 主要试剂
•     3.2.4 溶液和培养基的配置
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 菌株的培养和保存方法
•     3.3.2 重组载体构建
•     3.3.3 重组毕赤酵母菌株的构建和筛选
•     3.3.4 目的基因拷贝数的测定
•     3.3.5 重组RML摇瓶发酵与酶活检测
•     3.3.6 重组RML酶学性质分析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 重组载体的构建
•     3.4.2 重组毕赤酵母菌株的构建和筛选
•     3.4.3 目的基因拷贝数的鉴定
•     3.4.4 重组RML摇瓶发酵与酶活检测
•     3.4.5 重组RML酶学性质分析
•   3.5 本章小结
• 结论与展望
•   结论
•   创新点
•   展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苗杨利

导师: 韩双艳

关键词: 米黑根毛霉脂肪酶,毕赤酵母,表面展示,蛋白酶缺陷,信号肽

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华南理工大学

分类号: Q78

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.000526

总页数: 76

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