巴氏醋酸杆菌乙酸胁迫下生理和适应性进化初步研究

论文摘要

高效率的醋酸发酵需要具有较高乙酸耐受性的醋酸菌,本文首先比较了亲本株Acetobacter pasteurianus CICIM B7003与突变株Acetobacter pasteurianus CICIM B7003-02发酵过程中生理和胞内微环境来揭示其生理水平的耐酸机制,后对突变株的培养条件和发酵过程进行了优化。乙酸耐受性增强的菌株涉及多个代谢路径中的基因突变,最后在亲本株和突变株中进行了比较基因组和酸胁迫下适应性进化初步分析。主要研究结果如下:（1）以Acetobacter pasteurianus CICIM B7003及其突变株Acetobacter pasteurianus CICIM B7003-02为研究对象,在7.5 L发酵罐中比较分批和半连续发酵过程中发酵动力学以及胞内微环境变化。10 g?L-1底酸存在下,分批和半连续发酵中突变株的启动阶段明显缩短,产酸阶段突变株产酸速率略高,耐酸过程与产酸阶段相对分裂,突变株中与产酸直接相关的乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH）和乙醛脱氢酶（Acetaldehyde dehydrogenase,ALDH）的最高酶活分别提高27.0%和15.2%,辅酶Q9含量提高69.5%。胞内微环境分析表明,突变株中十八碳烯酸含量比亲本株高31.5%,与比生长速率呈正相关的胞内ATP含量是亲本株2.33倍,胞内谷氨酸和天冬氨酸含量分别比亲本株提高10.7%和18.3%。突变株主要依靠加强乙醇呼吸链,增强ATP合成和关键氨基酸代谢等机制的协同作用提高酸胁迫抗性。（2）为达到耐酸能力与产酸能力的协调一致,以A.pasteurianus CICIM B7003-02为研究对象,基于乙醇呼吸链途径,从通气速率优化和加强呼吸链辅酶Q9合成两个方面进行了产酸优化。首先进行不同通气速率下发酵动力学对比,建立了两阶段的通气发酵策略。后基于外源Fe2+以及异戊烯醇调控,建立两阶段通气速率下的乙醇呼吸链营养因子强化发酵策略。结果显示,0.25 vvm的通气速率显著提高了初始生物量的积累,0.35vvm的通气速率提高了后期的产酸速率,溶氧降低至临界氧气浓度10%左右外源添加异戊烯醇和Fe2+显著提高了发酵效率,35 h发酵结束,最终酸度为52.8 g?L-1,产酸速率达1.51 g?L-1?h-1。半连续发酵中平均产酸速率为1.67 g?L-1?h-1,相对未优化的1.01 g?L-1?h-1提高了65.01%。（3）为探究突变株在基因和转录层面的耐酸机制,测定了A.pasteurianus CICIM B7003的基因组序列,其编码所有被报道具有乙酸耐受性的基因。与其它种内菌株对比显示,乙醇呼吸链以及三羧酸循环供能途径基因相对保守。与A.pasteurianus CICIM B7003-02基因组对比显示,少数呼吸链及代谢基因出现了突变,包括F1F0 ATP酶的α亚基,PQQ-葡萄糖脱氢酶,泛醌细胞色素c还原酶和烟酸脱氢酶亚基B。供能途径中呼吸链基因,三羧酸循环基因以及应激蛋白基因不同酸度下转录水平大部分呈上调趋势。呼吸链及代谢路径中突变基因转录水平分析显示,突变株中fapA,cyc1,gcd,nhaP,marR,mp1,pdc等基因在0,10 g?L-1,20 g?L-1,30 g?L-1乙酸存在下转录水平都呈现上调趋势,mutS呈现下调趋势,其失活导致突变率大幅度上升。转录因子marR和膜蛋白基因mp1上游的插入缺失可能与乙酸耐受性有关。（4）为探究巴氏醋酸杆菌酸胁迫下适应性进化机制,以原始菌株A.pasteurianus CICIM B7003、诱变菌株A.pasteurianus CICIM B7003-02、模式菌株A.pasteurianus ATCC 33445为出发菌株,在20 g·L-1和30 g·L-1两个醋酸启动浓度下分别适应性驯化培养四个月,得到6株醋酸进化菌株P20,M20,T20,P30,M30,T30。共有突变基因富集分析表明突变主要集中在转录因子和膜蛋白上,代谢途径酶相对较保守。进化菌株种间对比显示,非同义突变率表现为M20>P20>T20,M30>P30>T30,突变频率表现为T20>P20>M20,T30>P30>M30。另外,M20和M30拥有最少的突变位点,A.pasteurianus CICIM B7003-02较高产酸和耐酸性能可能限制了耐酸适应性突变,此外,筛选了酸适应性突变基因（包含2种以上突变类型）,包括磺酸ATP结合ABC转运蛋白基因（APA01RS06905）,乳酸脱氢酶（APA01RS15365）,DEAD/DEAH盒解旋酶基因（APA01RS14860）,XRE家族转录调节因子（APA01RS15625,APA01RS15630）等。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 醋酸菌发酵研究进展
•     1.1.1 醋酸菌来源及分类
•     1.1.2 醋酸菌发酵特点
•     1.1.3 醋酸菌发酵模式
•   1.2 提升醋酸菌乙酸耐受性以及产酸策略
•     1.2.1 系统生物学
•     1.2.2 菌种改良
•     1.2.3 加强乙醇氧化呼吸链
•     1.2.4 营养补充
•   1.3 醋酸菌基因组研究进展
•     1.3.1 醋酸菌基因组特点
•     1.3.2 醋酸菌比较基因组学
•     1.3.3 基因型-表型关系
•   1.4 立题依据及主要研究内容
•     1.4.1 立题依据
•     1.4.2 主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 培养基
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 发酵罐分批发酵方法
•     2.2.2 发酵罐半连续发酵方法
•     2.2.3 发酵罐优化培养
•     2.2.4 A.pasteurianus CICIM B7003全基因组测序
•     2.2.5 进化培养
•     2.2.6 进化菌株重测序及分析
•   2.3 测定方法
•     2.3.1 发酵参数的测定
•     2.3.2 ATP含量的测定
•     2.3.3 细胞膜脂肪酸含量的测定
•     2.3.4 ADH和ALDH酶活的测定
•     2.3.5 辅酶Q9的测定
•     2.3.6 胞内氨基酸含量测定
•     2.3.7 荧光定量PCR
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 醋酸菌发酵动力学和生理学比较研究
•     3.1.1 A.pasteurianus CICIM B7003,CICIM B7003-02分批发酵过程比较
•     3.1.2 A.pasteurianus CICIM B7003,CICIM B7003-02半连续发酵过程比较
•     3.1.3 细胞膜脂肪酸含量变化
•     3.1.4 菌体胞内氨基酸含量变化
•     3.1.5 ADH,ALDH酶活力以及辅酶Q9含量变化
•   3.2 基于乙醇呼吸链的营养因子定向调控
•     3.2.1 两阶段通气速率调控发酵
•     3.2.2 乙醇呼吸链的营养因子调控
•     3.2.3 基于两阶段通气的营养因子半连续发酵优化
•   3.3 醋酸菌种内比较基因组学以及转录分析
•     3.3.1 A.pasteurianus CICIM B7003全基因组测序
•     3.3.2 Acetobacter种内比较基因组分析
•     3.3.3 产酸及能量代谢基因筛选
•     3.3.4 基因组突变基因转录分析
•     3.3.5 供能途径以及应激蛋白基因转录分析
•   3.4 适应性进化探究醋酸菌酸胁迫下进化机制
•     3.4.1 进化前后菌株生长和产酸差异
•     3.4.2 不同酸浓度下进化菌株的基因组突变
•     3.4.3 进化菌株共有突变基因分析
• 主要结论及展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录Ⅰ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录Ⅱ：基因组测序信息

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 史伟

导师: 夏小乐

关键词: 醋酸菌,微环境,基因组,进化,发酵优化

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ920.1;Q935

总页数: 71

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