小麦耐逆基因TaCaM1和TaMAPK3分子特征及功能研究

论文摘要

为了更好地适应多变的外界环境,植物体内进化出了一套抵御外界胁迫的分子机制,包括信号的感知、传导及下游的转录调控、应答反应等。其中钙信号转导途径和促分裂原活化蛋白激酶级联途径对植物应答外界胁迫起到了至关重要的作用。本试验对小麦钙调素基因TaCaM1和促分裂原活化蛋白激酶基因TaMAPK3的分子特征和抗逆特性进行了研究。主要研究结果如下:1、利用生物信息学方法,分析预测了小麦钙调素基因TaCaM1的核苷酸序列及编码的氨基酸序列,并对其进行了系统进化分析、同源氨基酸序列比对、跨膜螺旋域分析、三级结构预测和亚细胞定位预测。结果表明:TaCaM1的核苷酸序列全长为759bp,编码149个氨基酸,不含有跨膜螺旋域,预测的亚细胞定位主要在细胞质,少量位于细胞核。2、利用RT-PCR技术对TaCaM1在不同逆境下的表达特征进行分析,得知TaCaM1在低磷胁迫下表达量减少,在低氮、盐分和干旱胁迫下表达量均略有增加。3、利用DNA重组技术构建了融合TaCaM1的正、反义双元表达载体及融合TaCaM1和TaMAPK3的亚细胞定位表达载体;利用农杆菌介导法对TaCaM1进行烟草和小麦的遗传转化,获得了正、反义转基因烟草植株及超表达该基因的小麦植株。利用注射烟草结合荧光检测的方法对TaCaM1和TaMAPK3表达的蛋白进行亚细胞定位检测,表明TaCaM1定位于细胞质与细胞核,TaMAPK3定位于细胞核。4、利用土培法和水培法对TaCaM1正、反义转基因烟草株系进行了抗逆功能鉴定,发现在低磷胁迫下,与野生型烟草相比,正义系烟草植株生长单薄柔弱,根系短,叶面积小,叶绿素含量低,鲜干重小,反义系烟草植株茂盛健壮,根系长,叶面积大,叶绿素含量高,鲜干重大;而在低氮、盐分和干旱胁迫下,正义系烟草植株较野生型长势茂盛,根系长,叶面积大,叶绿素含量高,鲜干重大;反义系弱小,根系短,叶面积小,叶绿素含量低,鲜干重小。说明TaCaM1基因对低磷、低氮、盐分及干旱逆境具有一定的调控作用。5、结合课题组前期工作,对TaMAPK3转基因系烟草在干旱、盐分及ABA胁迫下的气孔特征进行观察分析,结果表明,在盐分胁迫下,TaMAPK3转基因系烟草较野生型气孔关闭较快,说明高盐逆境下TaMAPK3可能通过调控下游基因功能,快速积累ABA,进而促进气孔关闭,减少蒸腾,抵御渗透胁迫。6、利用高通量测序技术,对低磷逆境处理48h的TaMAPK3转基因系烟草和野生型烟草转录组进行了分析,探究了两者差异基因的GO功能富集及KEGG代谢通路的富集情况。结果表明其差异基因的GO功能主要富集在对伤害的响应及多种代谢酶活性调节;KEGG代谢通路主要富集在异喹啉生物碱生物合成、二苯乙烯、二芳基庚酸和姜醇的生物合成、氨基酸的生物合成、酪氨酸代谢和丙酮酸代谢等方面。表明TaMAPK3可能通过激活相关抗逆基因,调控相应代谢过程,响应低磷逆境。7、利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术进行TaMAPK3互作蛋白的筛选,表明TaMAPK3与TaWRKY46有互作关系。说明TaMAPK3可能通过调控下游WRKY型转录因子基因进而发挥抗逆功能。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 1 引言
•   1.1 植物钙调素与钙信号转导通路
•     1.1.1 植物钙调素的结构特征与功能
•     1.1.2 钙信号转导通路的产生
•     1.1.3 钙信号转导通路对植物生长发育及抵御逆境的调节作用
•   1.2 植物MAPK级联途径
•   1.3 蛋白互作的研究方法
•     1.3.1 酵母双杂研究蛋白互作的分子机制
•     1.3.2 双分子荧光技术研究蛋白互作的分子机制
•   1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 目的基因序列的获得
•   2.2 TaCaM1 核苷酸水平系统进化分析
•   2.3 TaCaM1 蛋白水平特征分析
•     2.3.1 TaCaM1 编码氨基酸序列及保守结构域分析
•     2.3.2 TaCaM1 同源氨基酸序列比对
•     2.3.3 TaCaM1 蛋白的跨膜螺旋区分析及三级结构预测
•     2.3.4 TaCaM1 蛋白的亚细胞定位预测
•   2.4 TaCaM1 在不同胁迫下的表达特征
•     2.4.1 小麦RNA的提取
•     2.4.2 反转录合成cDNA
•     2.4.3 检测cDNA
•     2.4.4 TaCaM1 基因表达特征的检测
•   2.5 融合载体的构建
•     2.5.1 融合TaCaM1 正、反义序列双元表达载体的构建
•     2.5.2 融合TaCaM1和Ta MAPK3 亚细胞定位表达载体的构建
•     2.5.3 融合TaCaM1和Ta MAPK3 酵母双杂载体的构建
•   2.6 TaCaM1 正、反义表达载体烟草和小麦的遗传转化
•     2.6.1 烟草遗传转化
•     2.6.2 小麦遗传转化
•   2.7 转基因烟草耐逆功能鉴定
•     2.7.1 利用土培法鉴定TaCaM1 转基因烟草的形态特征
•     2.7.2 利用水培法鉴定TaCaM1 转基因烟草的形态特征
•     2.7.3 TaCaM1 转基因烟草生理特征分析
•     2.7.4 利用不同逆境胁迫鉴定TaMAPK3 转基因株系的气孔特征
•     2.7.5 TaMAPK3 转基因烟草株系转录组的研究
•   2.8 TaCaM1和TaMAPK3 的亚细胞定位检测
•   2.9 TaMAPK3 互作蛋白的筛选
•     2.9.1 酵母转化及筛选互作蛋白
•     2.9.2 双分子荧光验证蛋白互作
• 3 结果与分析
•   3.1 目的基因序列的获得
•   3.2 TaCaM1 核苷酸水平系统进化分析
•   3.3 TaCaM1 蛋白水平特征分析
•     3.3.1 TaCaM1 编码氨基酸序列及保守结构域分析
•     3.3.2 TaCaM1 同源氨基酸序列比对
•     3.3.3 TaCaM1 蛋白的跨膜螺旋区分析及三级结构预测
•     3.3.4 TaCaM1 蛋白的亚细胞定位预测
•   3.4 TaCaM1 在不同胁迫下的表达特征
•   3.5 融合载体的构建
•     3.5.1 融合TaCaM1 正义序列双元表达载体的构建
•     3.5.2 融合TaCaM1 反义序列双元表达载体的构建
•     3.5.3 融合TaCaM1 亚细胞定位载体的构建
•     3.5.4 融合Ta MAPK3 亚细胞定位载体的构建
•   3.6 TaCaM1 烟草、小麦转基因系的建立
•     3.6.1 TaCaM1 正、反义烟草转基因系的建立
•     3.6.2 TaCaM1 正义小麦转基因株系的建立
•   3.7 转基因烟草耐逆功能鉴定
•     3.7.1 土培法鉴定TaCaM1 转基因烟草的抗逆特征
•     3.7.2 水培法鉴定TaCaM1 转基因烟草的抗逆特征
•     3.7.3 TaCaM1 转基因烟草生理指标测定
•     3.7.4 TaMAPK3 在不同逆境胁迫下气孔的特征分析
•     3.7.5 TaMAPK3 转基因系转录组的研究结果
•   3.8 TaCaM1和TaMAPK3 蛋白的亚细胞定位检测
•   3.9 TaMAPK3 互作蛋白的筛选
•     3.9.1 酵母转化及筛选互作蛋白
•     3.9.2 双分子荧光互补验证蛋白互作
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王卓

导师: 路文静,肖凯

关键词: 钙调素,促分裂原活化蛋白激酶,遗传转化,抗逆特性,酵母双杂,双分子荧光互补

来源: 河北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 河北农业大学

分类号: Q943.2;S512.1

DOI: 10.27109/d.cnki.ghbnu.2019.000012

总页数: 72

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