副干酪乳杆菌素的分离纯化、抑菌特性及机理初探

论文摘要

乳酸菌素是一类具备抑菌杀菌作用的蛋白质或多肽,是一种生物防腐剂,可应用于食品工业。本研究以课题组从浓香型窖泥中已分离出的19株乳酸菌为出发菌株,通过琼脂扩散法筛选出一株具有较强抑菌效果的菌株SLP16。经试验排除酸、过氧化氢的干扰和蛋白酶处理试验,判定菌株SLP16所产抑菌物质具备了蛋白质属性,是一种乳酸菌素。通过形态、生理生化和16S rRNA序列分析,鉴定出菌株SLP16为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）,其所产乳酸菌素命名为Lactocins SLP16。结合单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验,得到产Lactocins SLP16的改良MRS培养基:葡萄糖20 g,大豆蛋白胨11.63 g,酵母膏5 g,乙酸钠7.02 g,牛肉膏10 g,柠檬酸氢二铵2 g,KH2PO4 2 g,MnSO40.25g,MgSO4 0.78 g,Tween-80 1 mL,水1000 mL。通过正交法得到产Lactocins SLP16的最佳发酵条件:发酵时间36 h,初始pH6,接种量6%,培养温度37℃。运用该配比及发酵条件进行验证试验,效价达1.8×104 IU/mL,为原来的3.31倍。对菌株SLP16进行液体发酵,采用双水相萃取获得粗提的乳酸菌素,用正交法优化萃取条件为22%的PEG2000,18%的硫酸铵,pH3,再经透析、冷冻干燥和Sephadex G-75凝胶柱层析获得纯的乳酸菌素,最终得率为81.3%,纯化了59.2倍,效价达2.3×105 IU/mL。通过SDS-PAGE电泳法测得Lactocins SLP16分子量为26 kDa。经氨基酸检测出Lactocins SLP16有17种氨基酸,甘氨酸含量最高。Lactocins SLP16作用于Bacillus subtilis的最小抑菌浓度为12.5μg/mL,最小杀菌浓度为50μg/mL。Lactocins SLP16具有良好的热稳定性,经121℃高温高压处理20 min仍保持90%的抑菌活性;在pH2-10范围内具有酸碱耐受性,但只在酸性和中性环境中才有抑菌效果;经过紫外线照射其抑菌活性保持在80%以上;抑菌谱广,对Bacillus subtilis、Escherichia coli和Staphylococcus aureus及某些乳酸菌有抑菌效果,对某些霉菌和酵母菌无抑菌效果。Lactocins SLP16对Bacillus subtilis的抑制作用为使其胞内核酸、蛋白类物质和带电物质大量泄漏,导致细胞不能正常合成所需的能量物质,扫描电镜观察处理后的Bacillus subtilis形态,出现自溶、孔洞、畸形和破碎等现象,导致细胞死亡。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 1 绪论
•   1.1 研究背景
•     1.1.1 乳酸菌素的定义
•     1.1.2 乳酸菌素的分类
•   1.2 研究目的和意义
•   1.3 国内外研究现状
•     1.3.1 影响乳酸菌素活性的因素
•     1.3.2 乳酸菌素的分离纯化
•     1.3.3 乳酸菌素的抑菌机理
•     1.3.4 乳酸菌素的应用
•     1.3.5 副干酪乳杆菌的研究现状
•   1.4 本论文研究的主要内容、难点及技术路线
•     1.4.1 主要内容
•     1.4.2 重点和难点
•     1.4.3 技术路线
• 2 高产细菌素乳酸菌的筛选鉴定
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料与试剂
•     2.1.2 培养基
•     2.1.3 仪器与设备
•     2.1.4 方法
•   2.2 结果与讨论
•     2.2.1 产抑菌物质乳酸菌的筛选
•     2.2.2 乳酸菌所产抑菌物质的确定
•     2.2.3 产细菌素乳酸菌的鉴定
•     2.2.4 抑菌动力学曲线
•     2.2.5 效价结果
•   2.3 小结
• 3 Lb.paracasei SLP16发酵培养基成分及培养条件的优化
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 材料与试剂
•     3.1.2 仪器与设备
•     3.1.3 方法
•   3.2 结果与讨论
•     3.2.1 响应面法优化发酵培养基成分
•     3.2.2 正交法优化发酵条件
•   3.3 小结
• 4 Lactocins SLP16的分离纯化
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 材料与试剂
•     4.1.2 仪器与设备
•     4.1.3 方法
•   4.2 结果与讨论
•     4.2.1 pH值吸附法效果
•     4.2.2 硫酸铵沉淀法效果
•     4.2.3 双水相萃取法分离效果
•     4.2.4 Sephadex G-75凝胶层析
•     4.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳
•     4.2.6 高效液相测定纯度
•     4.2.7 纯化效果
•     4.2.8 氨基酸分析
•   4.3 小结
• 5 Lactocins SLP16的抑菌特性和抑菌机理初探
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 材料与试剂
•     5.1.2 仪器与设备
•     5.1.3 方法
•   5.2 结果与讨论
•     5.2.1 MIC和MBC结果
•     5.2.2 pH耐受性
•     5.2.3 热敏感性
•     5.2.4 化学试剂敏感性
•     5.2.5 紫外线敏感性
•     5.2.6 抑菌谱测定
•     5.2.7 Lactocins SLP16对指示菌生长曲线的影响结果
•     5.2.8 指示菌胞内核酸及蛋白类物质泄漏结果
•     5.2.9 Lactocins SLP16对指示菌电导率的影响结果
•     5.2.10 指示菌形态变化结果
•   5.3 小结
• 6 结论与展望
•   6.1 主要结论
•   6.2 创新点
•   6.3 研究展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 舒梨

导师: 赵兴秀

关键词: 副干酪乳杆菌,乳酸菌素,分离纯化,抑菌特性,抑菌机理

来源: 四川轻化工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 四川轻化工大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27703/d.cnki.gsclg.2019.000022

总页数: 78

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